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積層化細胞シートの作製方法及び積層化細胞シート

国内特許コード P190016130
整理番号 H28-063
掲載日 2019年6月14日
出願番号 特願2017-117568
公開番号 特開2019-000038
出願日 平成29年6月15日(2017.6.15)
公開日 平成31年1月10日(2019.1.10)
発明者
  • 濱野 公一
  • 上野 耕司
  • 細山 徹
  • 竹内 由利子
  • 溝口 高弘
出願人
  • 国立大学法人山口大学
発明の名称 積層化細胞シートの作製方法及び積層化細胞シート
発明の概要 【課題】本発明の課題は、基材から剥がしても縮みにくく、かつ作製が容易な積層化細胞シートの作製方法を提供することにある。
【解決手段】(a)培地を加えた培養基材上で、播種された2.0×10~2.5×10個/cmの繊維芽細胞を培養して積層化細胞シートを作製する工程;(b)酵素処理により該積層化細胞シートを培養基材から剥離する工程;の工程(a)、(b)を備えた積層化細胞シートを作製する。工程(b)で剥離後の積層化細胞シートの厚さが15μm以上であることが好ましい。
【選択図】図12
従来技術、競合技術の概要

細胞移植療法は様々な疾患や組織損傷に対する有効な治療手段として注目されている。細胞を移植するにあたって、単に細胞を移植しても細胞が組織に着床し難い。そのため、細胞移植療法においては、移植する細胞をシート状に培養した細胞シートが用いられている。この細胞シートを用いることで、移植する細胞を所定の組織に定着させることが可能となる。

細胞シートを作製するには、細胞を培養して細胞シートとした後、その細胞シートを培養基材から剥がして回収する工程が必要となる。かかる工程において、細胞シートを容易に基材から剥がすために、回収できる標的物質に対して親和性を有する領域と温度応答性高分子よりなる領域とが相分離した表面を有する温度応答型分離材料を用いる方法が提案されている(特許文献1参照)。

また、本発明者らは、難治性皮膚潰瘍を治療する上で有用な細胞シートとして、トランスフォーミング増殖因子又は血小板由来増殖因子による刺激を受けた線維芽細胞を含む細胞シートを提案した(特許文献2参照)。

さらに、所定の密度の筋芽細胞を、有効量の成長因子を含まない細胞培養液中で培養する細胞シートの製造方法が提案されている(特許文献3参照)。

一方、より細胞シートによる治療効果を高めるために、細胞シートを積層化する研究も進められている。たとえば、ゲル内部に培地を灌流するための流路を設け、血管内皮細胞を誘導させ、ゲル内に血管網を構築させた血管床を作製し、その血管床上へ細胞シートを積層することで細胞シート内に血管網を構築させて得られる3層以下の細胞シートを複数回に分けて積層化する方法(特許文献4参照)や、ハイドロゲル粒子を用いて細胞シートを積層化させる方法(特許文献5参照)が提案されている。このほか、単層の細胞シートを作製して1枚ずつ積み重ねるという方法も行われている。

産業上の利用分野

本発明は積層化細胞シートの作製方法及び積層化細胞シートに関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
以下の工程(a)、(b)を備えた積層化細胞シートの作製方法。
(a)培地を加えた培養基材上で、播種された2.0×10~2.5×10個/cmの繊維芽細胞を培養して積層化細胞シートを作製する工程;
(b)酵素処理により該積層化細胞シートを培養基材から剥離する工程;

【請求項2】
工程(b)で剥離後の積層化細胞シートの厚さが15μm以上である請求項1記載の積層化細胞シートの作製方法。

【請求項3】
工程(a)において、20時間以上間隔をあけて複数回に分けて繊維芽細胞を播種し、1回当たりの播種する繊維芽細胞数が1.5×105個/cm以下であることを特徴とする請求項1又は2記載の積層化細胞シートの作製方法。

【請求項4】
工程(a)において、0.5~12日間培養することを特徴とする請求項1~3のいずれか記載の積層化細胞シートの作製方法。

【請求項5】
培養基材の材料が、プラスチック又はガラスであることを特徴とする請求項1~4のいずれか記載の積層化細胞シートの作製方法。

【請求項6】
工程(a)において、さらに以下の工程(a-1)、(a-2)を備えたことを特徴とする請求項1~5のいずれか記載の積層化細胞シートの作製方法。
(a-1)工程(a)で作製した積層化細胞シートを凍結する工程;
(a-2)工程(a-1)で凍結した積層化細胞シートを融解する工程;

【請求項7】
工程(a)で、播種された2.0×10~2.5×10個/cmの繊維芽細胞及び0.1×106~1.2×10個/cmの末梢血単核球を培養することを特徴とする請求項1~6のいずれか記載の積層化細胞シートの作製方法。

【請求項8】
酵素処理が、ディスパーゼ処理であることを特徴とする請求項1~7のいずれか記載の積層化細胞シートの作製方法。

【請求項9】
請求項1~8のいずれかに記載の積層化細胞シートの作製方法によって作製された積層化細胞シート。

【請求項10】
請求項1~8のいずれかに記載の積層化細胞シートの作製方法によって作製された難治性皮膚潰瘍治療用積層化細胞シート。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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出願権利状態 公開
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