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(In Japanese)ヘモグロビンのメト化抑制能を有する人工赤血球 meetings

Patent code P190016148
File No. (S2016-0227-N0)
Posted date Jun 24, 2019
Application number P2018-503383
Date of filing Mar 1, 2017
International application number JP2017008187
International publication number WO2017150637
Date of international filing Mar 1, 2017
Date of international publication Sep 8, 2017
Priority data
  • P2016-040494 (Mar 2, 2016) JP
Inventor
  • (In Japanese)酒井 宏水
  • (In Japanese)山田 孫平
Applicant
  • (In Japanese)公立大学法人奈良県立医科大学
Title (In Japanese)ヘモグロビンのメト化抑制能を有する人工赤血球 meetings
Abstract (In Japanese)メトヘモグロビンを還元する酵素活性が実質的にない精製濃縮ヘモグロビンを含む人工赤血球において、ヘモグロビンのメト化を抑制する。
NADH及び/又はNADPHと、ヘモグロビンとを含む水溶液と、該水溶液を内包するカプセルとからなり、前記水溶液及びカプセルはメトヘモグロビンを還元する酵素活性が実質的にない、人工赤血球を提供する。
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

現行の医療において、献血・輸血システムは不可欠の技術であり、高い安全性を誇っている。しかし、輸血による感染の可能性は完全には無くなっていない。また、新興感染症の脅威にも晒されている。医療過誤により血液型の異なる血液を患者に投与する事故が発生している。また、緊急輸血を必要とする際の血液型交叉試験は困難な場合が多い。献血後、濃厚赤血球バッグは、日本では冷蔵で3週間、欧米では6週間あまりであり、期限が切れると廃棄せざるをえない。保存期間が短いため、大規模災害や有事など輸血用血液の需要が高くなる際に、輸血用血液を十分に供給できなくなる可能性がある。

これらの問題点を克服するため、人工血液製剤が開発されてきた(非特許文献1)。血液に含まれる蛋白質のうち、最も多くあるのがヘモグロビンである。ヘモグロビンは酸素を可逆的に結合-解離する蛋白質であり、要するに血液の主要な機能は酸素運搬であり、酸素供給が生命の維持に如何に重要であるかを示している。ヘモグロビンが酸素を結合解離することは古くから知られていたので、人工酸素運搬体(人工赤血球)として開発されてきた物質としては、ヘモグロビンを加工したものが多い。いわゆる修飾ヘモグロビンとは、(i) ヘモグロビンがサブユニットに解離することを防いだ分子内架橋ヘモグロビンや、(ii) ヘモグロビンの分子量を大きくするために、グルタルアルデヒドや活性化ラフィノーズなどで分子間架橋した重合ヘモグロビン、また、(iii) ポリエチレングリコールやデキストラン、アルブミンを化学的に結合させた高分子結合ヘモグロビンなどである。修飾ヘモグロビンは製造法が比較的簡単なため、臨床試験にまで進んだものが多いが、ほぼ全てについて毒性が明らかになり、開発を中断している。その原因は、ヘモグロビンが血管内皮弛緩因子である一酸化窒素(NO)と強い親和性、あるいは反応性があり、NOを失活させて結果として血管収縮を引起こし、末梢循環不全を引き起こすこと、また活性酸素等と反応したときに生じる副産物が血管壁に直接接触し、血管壁や心筋に損傷を与えること、また、粒子径が小さいために容易に血管外に漏出し、様々な副作用を引き起こすことなどが論じられている(非特許文献2)。つまり、本来赤血球の中にあるべきヘモグロビンが一旦赤血球から出ると(溶血すると)、毒性を示すことと同じなのである。

発明者らは、リポソームに内包した形式である、ヘモグロビンベシクル(Hb-V)を開発してきた。Hb-Vは、高純度高濃度ヘモグロビン(30-42g/dL)をリポソームに内包した人工赤血球である(非特許文献3)。リポソームの構成成分は、1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC)と、
cholesterolと、
1,5-O-dihexadecyl-N-succinyl-L-glutamate (DHSG)と、1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine-N-PEG5000(DSPE-PEG5000)との4成分である。Hb-V分散液のヘモグロビン濃度は10g/dLであり、粒子径は250-280nmに制御されている。これまでに動物投与試験により高い安全性が確認され、また、出血性ショックからの蘇生、高度血液希釈、貧血に対する投与、脳梗塞の梗塞領域の低減、虚血領域の酸素化、体外循環回路の補填液、臓器灌流液、COキャリアなどとして効果を示すことが動物実験モデルから明らかにされている。

ところで、ヘモグロビン1分子は4個のサブユニット(α2β2)から構成され、各サブユニットに酸素結合部位であるヘムが1つずつ存在する。ヘムの中心鉄が二価(ferrous、Fe2+)のときに酸素を可逆的に結合する。中心鉄が二価の状態で酸素を結合した状態をオキシヘモグロビン(HbO2)、酸素を結合していない状態をデオキシヘモグロビン(deoxyHb)とよぶ。酸素を結合したHbO2は、次第に自動酸化によって酸素を結合しない鉄三価(ferric、Fe3+)のメトヘモグロビン(metHb)に変化する。このとき以下の化学式の反応によりスーパーオキサイドアニオン(O2-・)を放出する。
HbO2 → metHb + O2-
O2-・は、不均化反応によって過酸化水素になり、HbO2及びdeoxyHbの酸化を促進する。赤血球内には、これらの反応を抑制するために、metHbを還元する仕組みや、活性酸素を除去する仕組みが含まれる。metHbを還元するシステムには以下のものが知られている。
(i)アスコルビン酸やグルタチオンなどの還元剤が直接metHbと反応して還元し、酸化したデヒドロアスコルビン酸と酸化型グルタチオンは酵素によって還元体に戻される。
(ii)ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド(NADH)を基質とするNADH系メトヘモグロビン還元酵素として、NADH-methemoglobin reductaseが報告されたが、これはNADH-cytochrome b5 reductaseの作用とcytochrome b5が電子媒体となってmetHbが還元される機構であることが明らかになっている。酸化型のNAD+はEmbden Myerhof 経路によってNADHに復元される。NADH cytochrome b5 reductaseは、赤血球膜中に存在するものと、赤血球中に溶解しているものがある。
(iii)ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドフォスフェート(NADPH)を基質とするNADPH methemoglobin reductaseの作用でmetHbが還元され、酸化型のNADP+はpentose phosphate経路によってNADPHに復元される。
(iv)また赤血球は、O2-・を過酸化水素に変換するスーパーオキサイドディスムターゼ(SOD)、過酸化水素を消去するカタラーゼ(CAT)を含有している。

人工酸素運搬体の製造の原料となるヘモグロビンは、ヒト赤血球や、家畜の赤血球から精製単離する。一般的な精製法としては、まず、抗凝固剤を含有した血液を遠心分離すると赤血球が沈降する。上澄みの血漿層と血小板、バッフィーコート(白血球)を取り除き、沈降した赤血球を回収する。これに生理食塩水を添加して赤血球を分散させ、遠心分離を行い、上澄みを除去し赤血球を回収する。この操作を2、3回繰り返すことにより洗浄赤血球を得ることができる。赤血球に蒸留水を添加していくと溶血し、ヘモグロビンが遊離する。この溶液を溶血血液(hemolysate)とよぶ。ストローマ(赤血球膜)成分を除去するには、(i)限外分子量1000kDa程度の限外濾過膜で処理し、水溶性物質のみを透過させ、ストローマ成分を除去する、あるいは、(ii)超遠心分離によりストローマ成分を沈殿として除去する。得られたヘモグロビン溶液は、ストローマフリーヘモグロビン(stroma free hemoglobin、SFHb)とよばれ、ヘモグロビンが主成分ではあるが赤血球中に含まれる水溶性の酵素系も共存している。そのあと、限外分子量8~10kDaの限外濾過膜で透析、濃縮させる。酵素系を含有しているストローマフリーヘモグロビンは、酵素の基質を添加してやれば、metHb還元系が復元できるので、上述のメト化を抑制することができる。また、粗製ヘモグロビン(SFHb)溶液に酵素系の基質を添加し、これをカプセルに内包して、人工赤血球とした場合、metHb還元酵素系を回転させることによって人工赤血球のメト化を遅延させることができる。

酵素類を含有するストローマフリーヘモグロビンを使うことの「欠点」は、ウィルス不活化・除去工程が不完全な状態になることである。ヒト赤血球由来のヘモグロビンであれば、それから作られる人工酸素運搬体は特定生物由来製剤に該当する。動物の赤血球由来であれば、生物由来製剤に該当する。いずれにしても、精製の工程に、ウィルス不活化・除去工程が導入されていること、またその不活化率・除去率 (Log Reduction Value)が規定値に比較して十分であることが求められる。ウィルス不活化工程としては、液状加熱処理(60℃、10時間)あるいはS/D処理(有機溶媒/界面活性剤処理)がある。これらは、ウィルスを変性させて失活させる。また、ウィルス除去工程としてナノフィルトレーション処理があり、フィルタの孔径(例えば15nm)よりも大きいウィルスは透過できないので除去できる。ヘモグロビンは球状タンパク質であり構造的に安定であるが、酵素類は不安定である。通常ヘモグロビンはヘムに酸素を結合しているが、これを一酸化炭素に変換(HbCO)、あるいは、酸素を排除してdeoxyHbに変換すると耐熱性を帯び、液状加熱処理が可能となり、ウィルスの不活化が可能になるが、加熱中にほぼ全ての酵素類が変性不溶化する(非特許文献4、5)。また、ナノフィルトレーションを使った場合は、ナノフィルトレーションの孔径よりも大きな酵素類は排除される。

発明者らは、感染源をすべて排除することが人工酸素運搬体(人工赤血球)に求められる条件であると理解し、赤血球からヘモグロビンを精製する工程に加熱処理とナノフィルトレーションを取り入れている。これによって、ウィルスのLog Reduction Valueは基準を満たし、製剤の安全度を格段に高めることができる。しかし、加熱処理及びナノフィルトレーションによって酵素系は全て消失するため、結果としてHbO2がメト化して鉄三価のmetHbとなり、鉄二価の状態に還元することができず、酸素運搬機能が漸減する。したがって、ウィルス不活化・除去工程を経て、酵素系を実質的に含有しない精製濃縮ヘモグロビンを用いる場合、これをカプセルに内包した人工赤血球製剤の開発において、上述のメト化を抑制する方法が必要になる。

これまでに様々な非酵素的なmetHb還元システムが検討されてきた。(i)グルタチオンやシステインなどのチオール類は、metHbと直接反応して還元することができる(非特許文献6)。この方法は、脱酸素状態で長期間保存する場合には、残存酸素を完全に消去し、metHbを完全に還元することに適している(特許文献1、非特許文献7)。しかし、metHb濃度が高くない状態で酸素が存在するとチオール類が溶存酸素と直接反応して活性酸素種を生じ、逆にメト化を促進する場合がある。(ii)電子伝達物質としてフラビン類と、電子供与体としてグルコースを精製濃縮ヘモグロビン溶液に添加して可視光照射によってmetHbを還元する方法を考案したが、光照射法は限定されており、実用的な方法とはならなかった(特許文献2)。(iii)アミノ酸のチロシンとメトヘモグロビンが共存すると、過酸化水素を消去する擬似カタラーゼ活性を示し、ある程度のメト化速度の抑制が見られるが、実用的な方法とはならなかった(特許文献3)。(iv)人工赤血球(ヘモグロビンベシクル)に対して、NADHとメチレンブルーを外から添加したところ、人工赤血球内のmetHbが還元された(非特許文献8)。これは、メチレンブルーがNADHと反応して還元型Leukomethylene blueになり、これが人工赤血球内に拡散してmetHbを還元したと考えられる。さらに、(v)人工赤血球(ヘモグロビンベシクル)を血管内投与したあとmetHbの含有量が増大した時点で、メチレンブルーをごく少量投与すると、メチレンブルーが血流中で赤血球内のNADHやNADPHと反応して還元型Leukomethylene blueになり、これが人工赤血球内に拡散してmetHbを還元し、効果が明確で、実用的あること明らかになった(非特許文献9)。しかし、Leukomethylene blueは酸素と反応して活性酸素を発生する場合があること、また皮膚の色調が青くなることが問題となった。したがって、酵素系を実質的に含有しないヘモグロビンを内包した人工赤血球製剤について、メト化を遅延又は抑制する別の手段による技術の開発が求められている。

また、血管内では血管壁から常に血管内皮弛緩因子として一酸化窒素(NO)が放出されているが、これがヘモグロビンと極めて高い反応性を示し、メト化を促進する。更に、炎症反応や虚血再灌流障害において、iNOSの誘導により血管内のNOの産生が亢進したり、好中球やマクロファージが活性化し、NADPH-オキシダーゼの作用でスーパーオキサイドの産生が亢進し、これが不均化で過酸化水素になり、これらもヘモグロビンと反応してメト化を促進することが問題となっている。したがって、体内における酸化的ストレスに対しても、人工赤血球製剤の機能として、過剰な内因性活性酸素、NOに対する新しい防御システムを保持させることが求められていた。この必要性は従来の人工赤血球あるいはカプセル化型ヘモグロビンの開発において、認識されていなかった。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、NADH及び/又はNADPHと、ヘモグロビンとを含む水溶液と、該水溶液を内包するカプセルとからなる人工赤血球及びその製造方法に関し、より具体的には、ヘモグロビンのメト化抑制能を有する人工赤血球及びその製造方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
NADH及び/又はNADPHとヘモグロビンとを含む水溶液と、該水溶液を内包するカプセルとからなり、前記水溶液及びカプセルはメトヘモグロビンを還元する酵素活性が実質的にない、人工赤血球。

【請求項2】
 
ヘモグロビンの50%メト化時間が72時間以上である、請求項1に記載の人工赤血球。

【請求項3】
 
前記カプセルに内包された水溶液中のヘモグロビン濃度は10g/dL~45g/dL(1.6mM~7.0mM)であり、該水溶液中のNADH及び/又はNADPHのモル濃度はヘモグロビンのモル濃度の0.5~10倍である、請求項1又は2に記載の人工赤血球。

【請求項4】
 
第2の水溶液中のヘモグロビンのモル濃度の0.5~3倍のモル濃度のpyridoxal 5'-phosphateを第2の水溶液中に含む、請求項1ないし3のいずれか1項に記載の人工赤血球。

【請求項5】
 
前記カプセルは、リポソーム、ポリマーソーム及び高分子薄膜からなる群から選択される少なくとも1つである、請求項1ないし4のいずれか1項に記載の人工赤血球。

【請求項6】
 
前記リポソームは、1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC)、
cholesterol、
1,5-O-dihexadecyl-N-succinyl-L-glutamate (DHSG)及び1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine-N-PEG50000 (DSPE-PEG5000)
からなる、請求項5に記載の人工赤血球。

【請求項7】
 
請求項1ないし6のいずれか1項に記載の人工赤血球を含む輸血代替用製剤。

【請求項8】
 
請求項1ないし6のいずれか1項に記載の人工赤血球を水溶液中に分散された状態で含み、さらに、該水溶液中に、電解質、糖質、アミノ酸、膠質、NADH及びNADPHからなる群から選択される少なくとも1種類の化合物を生理的に許容される濃度で含む、請求項7に記載の輸血代替用製剤。

【請求項9】
 
NADH及び/又はNADPHの水溶液を内包するカプセルを含む、NO、H2O2及びO2-・からなるグループから選択される少なくとも1つの物質の消去剤。

【請求項10】
 
人工赤血球の製造方法であって、
(a)ヘモグロビンを含む第1の水溶液からメトヘモグロビン還元する酵素活性を実質的に除去するステップと、
(b)第1の水溶液にNADH及び/又はNADPHを溶解して、実質的にメトヘモグロビンを還元する酵素活性がないヘモグロビンと、NADH及び/又はNADPHとを含む第2の水溶液を用意するステップと、
(c)第2の水溶液をカプセルに内包して、第2の水溶液とカプセルとからなる人工赤血球を得るステップとを含む、人工赤血球の製造方法。

【請求項11】
 
前記ステップ(a)は、第1の水溶液を60~65℃にて1~12時間加熱することを含む、請求項10に記載の人工赤血球の製造方法。

【請求項12】
 
第2の水溶液中のヘモグロビン濃度は10g/dL~45g/dL(1.6mM~7.0mM)であり、第2の水溶液中のNADH及び/又はNADPHのモル濃度はヘモグロビンのモル濃度の0.5~10倍である、請求項10又は11に記載の人工赤血球の製造方法。

【請求項13】
 
前記ステップ(b)において、第2の水溶液中のヘモグロビンのモル濃度の0.5~3倍のモル濃度のpyridoxal 5'-phosphateを第2の水溶液中に含む、請求項10ないし12のいずれか1項に記載の人工赤血球の製造方法。

【請求項14】
 
前記ステップ(b)は、pyridoxal 5'-phosphateを第1の水溶液又は第2の水溶液に溶解することを含む、請求項13に記載の人工赤血球の製造方法。

【請求項15】
 
前記カプセルは、リポソーム、ポリマーソーム及び高分子薄膜からなる群から選択される少なくとも1つである、請求項10ないし14のいずれか1項に記載の人工赤血球の製造方法。

【請求項16】
 
前記リポソームは、1,2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphatidylcholine (DPPC)、
cholesterol、
1,5-O-dihexadecyl-N-succinyl-L-glutamate (DHSG)及び1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphatidylethanolamine-N-PEG5000(DSPE-PEG5000)
からなる、請求項15に記載の人工赤血球の製造方法。

【請求項17】
 
請求項1ないし6のいずれか1項に記載の人工赤血球を含む、敗血症の治療、亜硝酸塩の大量摂取の治療及びNO吸入療法におけるメトヘモグロビン血症予防のための医薬組成物。

【請求項18】
 
請求項7又は8に記載の輸血代替用製剤を含む、請求項17に記載の医薬組成物。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2018503383thum.jpg
State of application right Published


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