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アルギン酸リアーゼ及び当該酵素を用いる不飽和ウロン酸単糖の製造方法 NEW 新技術説明会

国内特許コード P190016153
整理番号 (S2016-0651-N0)
掲載日 2019年6月24日
出願番号 特願2018-510583
出願日 平成29年4月3日(2017.4.3)
国際出願番号 JP2017013871
国際公開番号 WO2017175694
国際出願日 平成29年4月3日(2017.4.3)
国際公開日 平成29年10月12日(2017.10.12)
優先権データ
  • 特願2016-075364 (2016.4.4) JP
発明者
  • 柴田 敏行
  • 三宅 英雄
  • 村瀬 祥光
  • 田中 礼士
  • モリ テツシ
  • 竹山 春子
  • 高橋 真美
出願人
  • 国立大学法人三重大学
発明の名称 アルギン酸リアーゼ及び当該酵素を用いる不飽和ウロン酸単糖の製造方法 NEW 新技術説明会
発明の概要 【課題】 新規なアルギン酸リアーゼ及び当該酵素を用いた不飽和ウロン酸単糖の製造方法を提供すること。
【解決手段】 配列番号1に示されるアミノ酸配列又は当該配列と少なくとも90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を備えるものであって、アルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドによって達成される。このポリペプチドは、(a)ウロン酸部分を含むアルギン酸に対し、当該ポリペプチドを接触させる酵素添加工程、(b)前記アルギン酸とポリペプチドの混合物を前記エキソ型アルギン酸リアーゼ活性が働く温度で保持する酵素作用工程を備えた4-deoxy-L-erythro-5-hexoseulose uronic acid(DEH)の製造方法に用いられる。
【選択図】図10
従来技術、競合技術の概要

世界の水生植物の種類別生産量の割合を見ると、700万トン中68.6%を褐藻類が占め、その構成多糖類はアルギン酸が最も多く、約30%である。褐藻類はコンブやワカメなど一部は食用として利用されているが、大部分は未利用資源である。褐藻類は、耕地や新鮮な水、肥料を必要とせず、天然でゲル状に存在しているため、陸生バイオマスに比べると容易に酵素反応を行えるなどの利点が注目されている。特に日本は国土が海に囲まれ、世界でも有数の海洋面積を誇ることから、褐藻類の利用ができれば安定した原料供給源と成り得る。また、褐藻類の構成多糖類としてはアルギン酸が最も多いことから、アルギン酸の利用が重要となってくる。
アルギン酸はβ-D-マンヌロン酸とそのC5エピマーであるα-L-グルロン酸の2種のウロン酸がグリコシド結合で結合した直鎖状のポリマーであり(図1)、β-D-マンヌロン酸が結合したpoly(M)ブロック、α-L-グルロン酸が結合したpoly(G)ブロック、β-D-マンヌロン酸とα-L-グルロン酸が交互に結合したpoly(M・G)ブロックの3画分が混在している。

これまでに、アルギン酸を代謝することができる数種類の微生物が発見されており、これらの微生物はアルギン酸リアーゼを持つ。アルギン酸リアーゼはβ-eliminationによってグリコシド結合を切断するpolysaccharide lyases(PLs)に属する。現在、アルギン酸リアーゼはPL5、PL6、PL7、PL14、PL15、PL17、PL18ファミリーに分けられている。また、切断様式としては、ポリマーを飽和オリゴ糖と不飽和オリゴ糖に分解するエンド型のものと、ポリマーを飽和単糖や不飽和単糖に分解するエキソ型のものの2種類が知られている。現在のところ、PL5とPL7ファミリーはエンド型、PL15とPL17ファミリーはエキソ型であるとされている。
エキソ型アルギン酸リアーゼによる分解で生じた不飽和単糖は非酵素的反応により不飽和二重結合が開裂することにより開環し、4-deoxy-L-erythro-5-hexoseulose uronic acid(DEH)になる。一部の海洋微生物や代謝改変した発酵微生物はDEHを資化することで乳酸やコハク酸などの有機酸や、バイオエタノールなどのバイオ燃料を作ることができる。このため、DEHを効率的に製造する方法が研究されている(特許文献1、2、非特許文献1~5)。

産業上の利用分野

本発明は、アルギン酸リアーゼ及び当該酵素を用いる不飽和ウロン酸単糖の製造方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
配列番号1に示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を備えるものであって、エキソ型アルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチド。

【請求項2】
請求項1に記載のポリペプチドをコードするDNA。

【請求項3】
請求項2に記載のDNAを請求項1に記載のポリペプチドを発現可能な状態で有する発現用ベクター。

【請求項4】
(a)ウロン酸部分を含むアルギン酸に対し、請求項1に記載のポリペプチドを接触させる酵素添加工程と、
(b)前記アルギン酸とポリペプチドの混合物を前記エキソ型アルギン酸リアーゼ活性が働く温度で保持する酵素作用工程と、
を備える4-deoxy-L-erythro-5-hexoseulose uronic acid(DEH)の製造システム。

【請求項5】
配列番号2に示されるアミノ酸配列又は当該アミノ酸配列と少なくとも90%以上の相同性を有するアミノ酸配列を備えるものであって、エンド型アルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチド。

【請求項6】
請求項5に記載のポリペプチドをコードするDNA。

【請求項7】
請求項6に記載のDNAを請求項5に記載のポリペプチドを発現可能な状態で有する発現用ベクター。

【請求項8】
(c)ウロン酸部分を含むアルギン酸に対し、請求項1に記載のポリペプチド及びエンド型アルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドの二種類のポリペプチドを接触させる複数酵素添加工程と、
(d)前記アルギン酸と二種類のポリペプチドの混合物を前記アルギン酸リアーゼ活性が働く温度で保持する複数酵素作用工程と、
を備えるDEHの製造システム。

【請求項9】
前記エンド型アルギン酸リアーゼ活性を有するポリペプチドが、請求項5に記載のポリペプチドである請求項8に記載のDEHの製造システム。

【請求項10】
陰イオン分析用カラムと、移動相として一種類のギ酸含有アンモニウム緩衝液とを有するHPLC(高速液体クロマトグラフ)部を備えるDEH測定用LC-MS(液体クロマトグラフ質量分析計)装置。

【請求項11】
HPLC(高速液体クロマトグラフィー)において陰イオン分析用カラムを使用し、移動相として一種類のギ酸含有ギ酸アンモニウム緩衝液を用いるLC/MS(液体クロマトグラフィー質量分析)を用いたDEHの測定方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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JP2018510583thum.jpg
出願権利状態 公開
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