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細胞周期可視化プローブ NEW 実績あり 外国出願あり

国内特許コード P190016255
整理番号 07219
掲載日 2019年8月19日
出願番号 特願2009-505097
登録番号 特許第5370890号
出願日 平成20年2月6日(2008.2.6)
登録日 平成25年9月27日(2013.9.27)
国際出願番号 JP2008051973
国際公開番号 WO2008114544
国際出願日 平成20年2月6日(2008.2.6)
国際公開日 平成20年9月25日(2008.9.25)
優先権データ
  • 特願2007-068240 (2007.3.16) JP
発明者
  • 宮脇 敦史
  • 沢野 朝子
  • 正井 久雄
出願人
  • 公益財団法人東京都医学総合研究所
  • 国立研究開発法人理化学研究所
発明の名称 細胞周期可視化プローブ NEW 実績あり 外国出願あり
発明の概要 本発明は細胞周期の増殖期と休止期とを簡単にリアルタイムで識別することができる方法を提供することを目的とし、細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する1以上の遺伝子発現産物をマーカーとして可視化・検出することにより細胞周期の増殖期と休止期とを識別する、細胞周期の検出方法を提供することにより解決する。
従来技術、競合技術の概要 細胞周期は、細胞分裂で生じた細胞が、再び細胞分裂を行って新しい細胞になるまでの過程である。細胞周期において。有糸分裂の時期はM期と称され、通常、M期は約1時間で終了する。M期と、次のM期との間を間期と称され、細胞の成長、物質の生合成や代謝はこの時期に行われる。間期はさらに、G1期、S期、G2期に分類される。S期ではDNA複製が行われる。M期とS期との間の期間がG1期であり、S期とM期との間がG2期である。

細胞周期(G1期、S期、G2期、M期)の一部を調べる方法としては、BrdUラベルによる方法が知られている。具体的には、細胞内に一定の期間BrdUを取り込ませ、その後、抗BrdU抗体を使って免疫組織を行う方法であるが、リアルタイムでの観察は不可能である。また、細胞同調と生化学的手法による方法もあるが、リアルタイムでの観察は不可能である。

細胞周期の一部を可視化する方法としては、The G2M cell cycle phase marker (G"MCCPM) (Amersham Bioscience社)を用いる方法がある。この方法は、cyclinのプロモータ活性を利用しており、遺伝子導入によって形質転換を起こす際に、染色体への組み込まれ方で大きく影響されるという問題があった。また、G1期は可視化されていないので、細胞周期の追跡が困難であり、またコントラストが不明瞭であった。
産業上の利用分野 本発明は、細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する遺伝子発現産物をマーカーにより可視化して細胞周期を検出する方法、並びに上記方法で使用するための遺伝子構築物に関する。
特許請求の範囲 【請求項1】
細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する2以上の遺伝子発現産物をマーカーにより可視化して、前記マーカーを検出することによって細胞周期の増殖期と休止期とを識別することを特徴とする、細胞周期の検出方法において、
一つの細胞の中で、細胞周期依存的に細胞内で存在量が変化する2以上の遺伝子発現産物として、G1期で存在量が増加し、S/G2/M期で存在量が減少する第一の発現産物、及び、G1期で存在量が減少し、S/G2/M期で存在量が増加する第二の発現産物を少なくとも使用し、
上記第一の発現産物はCdt1からGeminin結合部位を除いた部分断片であり、上記第二の発現産物はGemininからCdt1結合部位を除いた部分断片であり、
上記第一の発現産物と第二の発現産物とはそれぞれ異なるマーカーで標識して可視化されている、ことを特徴とする、細胞周期の検出方法。

【請求項2】
第一の発現産物が、Cdt1の30から120番目のアミノ酸からなる部分断片である、請求項1に記載の方法。

【請求項3】
第二の発現産物が、Gemininの1から110番目のアミノ酸からなる部分断片である、請求項1又は2に記載の方法。

【請求項4】
マーカーが蛍光タンパク質又は発光タンパク質である、請求項1から3の何れかに記載の方法。

【請求項5】
生きた細胞又は組織を対象としたタイムラプスイメージング観察により、上記マーカーを経時的に検出することを特徴とする請求項1から4の何れかに記載の方法。

【請求項6】
Cdt1からGeminin結合部位を除いた部分断片をコードする遺伝子とマーカーをコードする遺伝子とを含む第一の遺伝子構築物、及び、GemininからCdt1結合部位を除いた部分断片をコードする遺伝子とマーカーをコードする遺伝子とを含む第二の遺伝子構築物(ただし、前記マーカーは互いに異なるものである)を、細胞内で共発現する、形質転換体、又は遺伝子導入非ヒト動物。

【請求項7】
Cdt1からGeminin結合部位を除いた部分断片をコードする遺伝子が、Cdt1の30から120番目のアミノ酸からなる部分断片をコードする遺伝子である請求項6に記載の形質転換体、又は遺伝子導入非ヒト動物。

【請求項8】
GemininからCdt1結合部位を除いた部分断片をコードする遺伝子が、Gemininの1から110番目のアミノ酸からなる部分断片をコードする遺伝子である請求項6又は7に記載の形質転換体、又は遺伝子導入非ヒト動物。

【請求項9】
マーカーをコードする遺伝子が、蛍光タンパク質又は発光タンパク質をコードする遺伝子である、請求項6から8の何れかに記載の形質転換体、又は遺伝子導入非ヒト動物。

【請求項10】
細胞周期阻害剤、又は細胞周期が関与する疾患用の薬剤の候補物質、あるいは特定の遺伝子発現を抑制する試薬の存在下において細胞を培養し、該細胞について請求項1から5の何れかに記載の細胞周期の検出方法を行うことによって細胞周期および/又は細胞死に影響を及ぼす候補物質を選択することを特徴とする、細胞周期阻害剤、又は細胞周期が関与する疾患用の薬剤のスクリーニング方法あるいは化合物、薬剤、試薬の効能、作用機序について検定する方法。

【請求項11】
細胞周期阻害剤、または細胞周期が関与する疾患用の薬剤の候補物質、あるいは特定の遺伝子発現を抑制する試薬を、請求項6から9の何れかに記載の遺伝子導入非ヒト動物に投与し、それらの、腫瘍の増殖、免疫系、血球系などの細胞の細胞周期、生存などに影響を及ぼす候補物質を選択することを特徴とする、疾患治療薬のスクリーニング方法あるいは化合物、薬剤、試薬の効能、作用機序について検定する方法。

【請求項12】
上記第一の発現産物が上記マーカーとしての赤色蛍光タンパク質で標識され、上記第二の発現産物が上記マーカーとしての緑色蛍光タンパク質で標識されていることを特徴とする請求項1に記載の細胞周期の検出方法。

【請求項13】
上記第一の遺伝子構築物がコードする上記マーカーが赤色蛍光タンパク質であり、上記第二の遺伝子構築物がコードする上記マーカーが緑色蛍光タンパク質であることを特徴とする請求項6から9の何れかに記載の形質転換体、又は遺伝子導入非ヒト動物。

【請求項14】
請求項6から9の何れかに記載の形質転換体又は遺伝子導入非ヒト動物の作成に用いられる細胞周期指示薬であって、Cdt1からGeminin結合部位を除いた部分断片をコードする遺伝子とマーカーをコードする遺伝子とを含む上記第一の遺伝子構築物、及び、GemininからCdt1結合部位を除いた部分断片をコードする遺伝子とマーカーをコードする遺伝子とを含む上記第二の遺伝子構築物、とを備えることを特徴とする細胞周期指示薬。

【請求項15】
上記第一の遺伝子構築物がコードする上記マーカーが赤色蛍光タンパク質であり、上記第二の遺伝子構築物がコードする上記マーカーが緑色蛍光タンパク質であることを特徴とする請求項14に記載の細胞周期指示薬。
国際特許分類(IPC)
出願権利状態 登録
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