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膜タンパク質の製造方法 NEW 実績あり 外国出願あり

国内特許コード P190016256
整理番号 07366
掲載日 2019年8月19日
出願番号 特願2009-540056
登録番号 特許第5704677号
出願日 平成20年11月5日(2008.11.5)
登録日 平成27年3月6日(2015.3.6)
国際出願番号 JP2008070116
国際公開番号 WO2009060857
国際出願日 平成20年11月5日(2008.11.5)
国際公開日 平成21年5月14日(2009.5.14)
優先権データ
  • 特願2007-286899 (2007.11.5) JP
発明者
  • 横山 茂之
  • 下野 和実
  • 白水 美香子
  • 五島 美絵
出願人
  • 国立研究開発法人理化学研究所
発明の名称 膜タンパク質の製造方法 NEW 実績あり 外国出願あり
発明の概要 脂質ディスク又はリポソーム内で天然構造又は活性構造に折りたたまれた膜タンパク質の製造方法を提供する。(a)膜タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ステロイド性界面活性剤と、リン脂質と、を含む無細胞タンパク質合成反応液を調製する工程、ここで、前記ステロイド性界面活性剤は、臨界ミセル濃度よりも高い濃度で含まれ、(b)前記反応液の界面活性剤濃度を低下させる工程、及び(c)前記膜タンパク質を合成すると共に、当該膜タンパク質を組み込んだ脂質ディスク又はリポソームを形成させる工程、を含む。(図5)
従来技術、競合技術の概要 各種ゲノムプロジェクトの成果に基づいて、様々な生物のゲノムにコードされているタンパク質の一次構造が明らかとなってきた。高等生物のタンパク質については、その約30%が膜貫通ヘリックスをもつ内在性膜タンパク質であると推定されている。膜タンパク質は、細胞膜におけるシグナル伝達、物質輸送、エネルギー生産、細胞骨格形成などに関与し、創薬ターゲットとしても極めて重要である。実際、市販されている医薬品の約70%が膜タンパク質、特にGタンパク質共役受容体に作用することが知られている。タンパク構造の重要性をふまえて取り組まれた我国のタンパク3000プロジェクトは、当初の目標を上回る数多くのタンパク質の立体構造を解明し、国際的にも高い成果を上げている。しかし、立体構造解析に適した膜タンパク質の結晶を作成することは難しいため、膜タンパク質の立体構造が解明された例は未だ少数である。

本出願人は、すでに無細胞タンパク質合成系を用いて難溶性タンパク質を界面活性剤の存在下において不溶化させることなく製造する方法を開発している(例えば、特許文献1、及び非特許文献1参照)。この方法は、多くの膜タンパク質を可溶性画分として大量に合成できるのもの、使用する界面活性剤がタンパク質合成を阻害しないものにのみ限定されるため、合成されたタンパク質の安定化に寄与する界面活性剤を選択できない場合がある。

また、単に脂質リポソームを無細胞タンパク質合成系に添加して、生物学的機能を担持した膜タンパク質の合成方法も報告されている(例えば、特許文献2、及び非特許文献2
参照)。しかし、リポソームへの挿入されやすさが個々の膜タンパク質の性質に大きく依存し、かつ合成されたポリペプチド鎖とリポソームとの接触確率が低いため、必ずしも汎用的ではないと考えられる。
産業上の利用分野 本発明は、無細胞タンパク質合成系を用いた膜タンパク質の製造方法に関し、詳しくは、無細胞タンパク質合成系で合成された膜タンパク質を脂質リポソームに組み込んだ状態で効率よく製造する方法に関する。
特許請求の範囲 【請求項1】
脂質ディスク又はリポソーム内で天然構造又は活性構造に折りたたまれた膜タンパク質の製造方法であって、
(a)膜タンパク質をコードするポリヌクレオチドと、ステロイド性界面活性剤と、リン脂質と、を含む無細胞タンパク質合成反応液を調製する工程、ここで、前記ステロイド性界面活性剤は、コール酸又はCHAPSであり、前記ステロイド性界面活性剤は、前記反応液中に臨界ミセル濃度の1.5~10倍の初期濃度で含まれ、
(b)前記反応液の界面活性剤濃度を低下させる工程、及び
(c)前記膜タンパク質を透析法を用いた無細胞タンパク質合成反応により前記界面活性剤濃度の低下に従って合成すると共に、合成された膜タンパク質を組み込んだ脂質ディスク又はリポソームを形成させる工程、
を含むことを特徴とする膜タンパク質の製造方法。

【請求項2】
前記無細胞タンパク質合成反応液が、初期濃度10~20mg/mlのコール酸ナトリウムを含む請求項1に記載の方法。

【請求項3】
前記無細胞タンパク質合成反応液が、初期濃度5~10mg/mlのCHAPSを含む請求項1に記載の方法。

【請求項4】
前記工程(b)が、前記界面活性剤に結合可能な樹脂を用いて前記界面活性剤を吸着することを含む請求項1に記載の方法。

【請求項5】
前記膜タンパク質が、受容体タンパク質、チャネルタンパク質、トランスポーター、膜結合酵素、又はその部分配列、相同配列、改変配列及び誘導配列を含む請求項1~4の何れか1項に記載の方法。

【請求項6】
さらに前記脂質ディスク又はリポソームとの複合体から膜タンパク質を可溶化し、当該膜タンパク質を精製する工程を含むことを特徴とする請求項1~5の何れか1項に記載の方法。

【請求項7】
請求項1~5の何れか1項に記載の方法により製造された膜タンパク質を脂質ディスク又はリポソームに組み込まれた状態で含むことを特徴とする薬剤のスクリーニング用組成物。
【請求項8】
請求項1~5の何れか1項に記載の方法により製造された膜タンパク質と、生理活性薬剤とを、脂質ディスク又はリポソームに組み込まれた状態で含むことを特徴とする薬剤送達用組成物。
国際特許分類(IPC)
画像

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出願権利状態 登録
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