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ELECTRODE HAVING ENZYME CRYSTALS IMMOBILIZED THEREON, METHOD FOR PRODUCING ELECTRODE HAVING ENZYME CRYSTALS IMMOBILIZED THEREON, AND BIOLOGICAL FUEL CELL AND BIOSENSOR PROVIDED WITH ELECTRODE HAVING ENZYME CRYSTALS IMMOBILIZED THEREON foreign

Patent code P190016272
File No. 07801
Posted date Aug 20, 2019
Application number P2012-530689
Patent number P5740754
Date of filing Aug 24, 2011
Date of registration May 15, 2015
International application number JP2011069060
International publication number WO2012026493
Date of international filing Aug 24, 2011
Date of international publication Mar 1, 2012
Priority data
  • P2010-189788 (Aug 26, 2010) JP
Inventor
  • (In Japanese)重森 康司
  • (In Japanese)中沖 優一郎
  • (In Japanese)美川 務
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人理化学研究所
Title ELECTRODE HAVING ENZYME CRYSTALS IMMOBILIZED THEREON, METHOD FOR PRODUCING ELECTRODE HAVING ENZYME CRYSTALS IMMOBILIZED THEREON, AND BIOLOGICAL FUEL CELL AND BIOSENSOR PROVIDED WITH ELECTRODE HAVING ENZYME CRYSTALS IMMOBILIZED THEREON foreign
Abstract Enzyme crystal immobilized electrode, and sensor and battery equipped with the electrode
Outline of related art and contending technology (In Japanese)近年、バイオマス資源を利用したバイオ電池が、その高いエネルギー効率及び低い環境負荷から次世代のエネルギーとして提案されている。微生物を始めとする生物は、酵素等の生体触媒により、炭水化物、タンパク質、脂質等を酸化分解する生体内代謝過程において、ATP等の化学エネルギー物質(結合エネルギー)を生成して、生命活動に必要なエネルギーを獲得している。バイオ電池は、かかる生体内代謝過程において発生するエネルギーを電気エネルギーとして電極に取り出す発電装置である。なかでも、酵素の基質特異的な触媒反応と電極反応を共役させる酵素燃料電池は、糖類やアミン類等の環境中に存在する化合物を燃料とできるため特に安全かつ環境負荷が低いクリーンな電源として注目されている。

酵素燃料電池の構築に際して、電極触媒となる酵素の選択は重要な要素となる。アノード(負極)側には燃料を酸化分解する酵素を、カソード(正極)側には酸素を還元する酵素を選択する。例えば、グルコースを燃料とする場合には、例えばグルコースデヒドロゲナーゼをアノード側の触媒として使用する。一方、カソード側の触媒としてラッカーゼ等を使用することができる(特許文献1)。ラッカーゼは、微生物・菌類・植物などに広く存在することが知られている酵素である。例えば、バチルス・サブティリス由来CotAラッ
カーゼ等が報告されており、配列決定及び結晶構造解析が行われている(非特許文献1、非特許文献2)。

酵素燃料電池の実用化に当たっては、酵素固定化電極の構築がその成否を左右することから、酵素の触媒機能を最大限に発揮できる酵素電極の構築が進められている。そして、現在までに、酵素や、電極と酵素との間の電子伝達を媒介する電子メディエーターを電極表面に固定化した種々の電極が報告されている。例えば、膜結合型酵素の疎水基とカーボン基材の疎水基との直接結合によって、膜結合型酵素がカーボン基材上に固定化された酵素電極(特許文献2)、及び、チトクロームC部位を含むタンパク質として構成された酵素を、疎水性面のカーボン製導電性基材上に固定化した酵素電極(特許文献3)の構築が報告されている。また、酵素や、電子メディエーターを導電性基材に固定化する際に、前記メディエーターを有機高分子鎖に結合させて高分子-メディエーター複合体を形成し、それを誘電率が24以下の溶媒に分散させることで分散性を向上させて導電性基材表面に塗布することにより、優れた電極性能を発現する酵素固定化電極が作製できたこと(特許文献4)、導電性基材に酵素を固定化する際に用いる溶液に有機溶媒を加えることにより、酵素の活性を損なうことなく、複雑な構造を有する電極であっても、酵素を電極内部に容易に浸透させて電極内部の表面に三次元的かつ高密度に固定化した電極が構築できたこと(特許文献5)が報告されている。さらに、正極と負極が電解質を介して対向した構造を有する電極が構築され、このなかで電極の一例としてカーボンフェルト製の導電性基材を用い、これに酵素を染み込ませることにより電極に酵素を固定したことが報告されている(特許文献6)。

しかしながら、上記した従来技術は、全て酵素を水や緩衝液に分散した溶液状態の酵素溶液を使用して、カーボン基材などの導電性基材に固定化するものである。そのため、電極上の酵素が不安定となり、酵素結合量に見合った電流値が得られないとの問題点あった。また、特許文献2に開示される電極は、その適用が膜結合型酵素に限定され、特許文献3に開示される電極は、親水的な表面を有する酵素に適用できない等、適用できる酵素の種類が限定されるという問題点もあった。

酵素電極において、充分な電流値を得るためには、酵素-電子メディエーター-電極間の円滑な電子伝達が必要である。そのため、より多くの酵素が電極表面上に近接する位置に存在することが求められる。つまり、酵素-電子メディエーター-電極の相互的な位置関係によって酵素電極の電極性能は大きく左右されることを意味する。そのため、酵素を電極表面へ固定化する際の濃度を高めることが優れた電極性能を発揮する酵素電極を得るためには重要であると考えられた。

しかしながら、酵素を溶液形態で導電性基材上に固定化する場合において、高濃度溶液を使用するには限界があった。酵素は親水性と疎水性をもつアミノ酸で構成され、溶液中では、親水性のアミノ酸が表面に存在するような構造体となっている。そのため、一般的には、数mg/ml程度の濃度であれば沈殿は生じない。一方で、酵素を高濃度にすると、酵素分子同時が近接したときに、偶発的に疎水性部分同士が相互作用をし、その結果、凝集、沈殿が生じ、酵素の変性を招き、酵素は不安定な状態に曝される。しかも、一度生じた沈殿は加速度的に増加していくこととなる。したがって、酵素溶液における酵素濃度が高くなる(一般的には、50 mg/cm3を超える)と、溶液中での酵素の分散性が悪くなり、酵素が導電性基材表面に凝集、つまり変性した状態で固定化されることなる。それによって、電極の電子伝達が円滑に進行しなくなり、得られる酵素電極は電極性能に劣るものとなるという問題点があった。

たとえば、特許文献2中の具体的開示によると、ここで電極構築の際に使用されている酵素溶液濃度は0.57 mg/mlであり、つまり、カーボン基材に固定化された膜結合型酵素の
最大量は1.11μg/cm2であった。また、特許文献3中の具体的開示によると、グラッシーカーボン電極に、1mg/mLの酵素溶液5μl滴下することにより構築したことが記載されている。つまり、使用した酵素溶液濃度は1 mg/mlであるから、カーボン基材に固定化された膜結合型酵素の最大量は71.4μg/cm2であった。更に、特許文献4の具体的開示によれば、カーボンペーパー表面に、酵素の5 mg/mLリン酸緩衝溶液を8μl滴下することにより構築したことが記載されている。つまり、使用した酵素溶液濃度は5 mg/mlであり、ここから算出すると、カーボン板へ固定化された酵素の最大量は51.0μg/cm2であった。さらに、特許文献5中の具体的開示によれば、13.8 mgの酵素を緩衝溶液200μlに溶解させ酵素溶液をグラッシーカーボンディスク電極表面上に滴下していることから、使用した酵素溶液濃度は69 mg/mlであり、特許文献6の具体的開示によれば、使用した酵素溶液濃度は50 mg/mlであった。このように、従来技術において固定化に使用される酵素濃度は上記の通りであると推定された。

また、酵素結合量に見合った電流量が得られない要因として、電極上での酵素結合の方向性(配向性)の最適化が不十分であることも挙げられる。酵素は溶液中では配向性を統一させること無く無秩序な状態で存在する。したがって、溶液状態で固定化を行うと、酵素はランダムな方向性を持って導電性基材に結合し、これにより出力の低下等を招く。そのため電極上で酵素の配向制御は、電極性能の観点から改善すべき技術課題の一つであった。更に、溶液状態での固定化は、酵素を一定の分散性を保ったまま電極に固定化することは困難であり、そのため電解質溶液中で電極から解離しやすく、酸化電流測定中に電流値が低下するとの問題点もあった。
Field of industrial application (In Japanese)本発明は、酵素結晶固定化電極及び酵素結晶固定化電極の製造方法、並びに酵素結晶固定化電極を備えるバイオ電池及びバイオセンサーに関する。詳細には、酵素結晶を導電性基材表面に固定化した酵素結晶固定化電極及び酵素結晶固定化電極の製造方法、並びに当該酵素結晶固定化電極を備えるバイオ電池及びバイオセンサーに関する。
Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
外部回路に接続可能な導電性基材と、電極触媒として酵素結晶を備え、前記酵素結晶が前記導電性基材に固定化された酵素結晶固定化電極を備えるバイオ電池。

【請求項2】
 
前記酵素結晶固定化電極が、微細化された導電性基材上に前記酵素結晶が固定化された微小電極として構成される請求項1に記載のバイオ電池。

【請求項3】
 
前記酵素結晶が、酸化反応を触媒する酵素の結晶である請求項1又は2に記載のバイオ電池。

【請求項4】
 
前記酵素結晶が、アシネトバクターカルコアセティカス由来のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの結晶である請求項3に記載のバイオ電池。

【請求項5】
 
前記アシネトバクターカルコアセティカス由来のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼが、下記(A)~(C)の何れかのアミノ酸配列を有する請求項4に記載のバイオ電池。
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列
(B)配列番号4に示すアミノ酸配列
(C)(A)または(B)のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列

【請求項6】
 
前記酵素結晶が、還元反応を触媒する酵素である請求項1又は2に記載のバイオ電池。

【請求項7】
 
前記酵素結晶が、バチルス・サブティリス由来のCotAラッカーゼの結晶である請求項6に記載のバイオ電池。

【請求項8】
 
前記バチルス・サブティリス由来のCotAラッカーゼが、下記(A)~(C)の何れかのアミノ酸配列を有する請求項7に記載のバイオ電池。
(A)配列番号6に示すアミノ酸配列
(B)配列番号8に示すアミノ酸配列
(C)(A)又は(B)のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列

【請求項9】
 
外部回路に接続可能な導電性基材に電極触媒として酵素結晶を固定化した酵素結晶固定化電極を備えるバイオ電池であって、
前記酵素結晶固定化電極が、酵素溶液からの酵素の結晶化を前記導電性基材上で行って前記導電性基材に酵素結晶を固定化することにより製造されるバイオ電池。

【請求項10】
 
前記酵素結晶固定化電極が、前記酵素の結晶化を蒸気拡散法の環境下において行うことによって製造される請求項9に記載のバイオ電池。

【請求項11】
 
酵素結晶固定化電極が、微細化された導電性基材上に前記酵素結晶が固定化された微小電極として構成される請求項9又は10に記載のバイオ電池。

【請求項12】
 
前記酵素結晶が、酸化反応を触媒する酵素の結晶である請求項9~11の何れか一項に記載のバイオ電池。

【請求項13】
 
前記酵素結晶が、アシネトバクターカルコアセティカス由来のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼの結晶である請求項12に記載のバイオ電池。

【請求項14】
 
前記アシネトバクターカルコアセティカス由来のピロロキノリンキノン依存性グルコースデヒドロゲナーゼが、下記(A)~(C)の何れかのアミノ酸配列を有する請求項13に記載のバイオ電池。
(A)配列番号2に示すアミノ酸配列
(B)配列番号4に示すアミノ酸配列
(C)(A)または(B)のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列

【請求項15】
 
前記酵素結晶が、還元反応を触媒する酵素の結晶である請求項9~11の何れか一項に記載のバイオ電池。

【請求項16】
 
前記酵素結晶が、バチルス・サブティリス由来のCotAラッカーゼの結晶である請求項15に記載のバイオ電池。

【請求項17】
 
前記バチルス・サブティリス由来のCotAラッカーゼが、下記(A)~(C)の何れかのアミノ酸配列を有する請求項16に記載のバイオ電池。
(A)配列番号6に示すアミノ酸配列
(B)配列番号8に示すアミノ酸配列
(C)(A)又は(B)のアミノ酸配列と90%以上の相同性を有するアミノ酸配列

【請求項18】
 
前記酵素結晶固定化電極を、アノードとして備える請求項3~5、及び12~14の何れか一項に記載のバイオ電池。

【請求項19】
 
前記酵素結晶固定化電極を、カソードとして備える請求項6~8及び15~17の何れか一項に記載のバイオ電池。

【請求項20】
 
請求項1~19の何れか一項に記載のバイオ電池を製造するためのバイオ電池の製造方法であって、アノードとカソードを対向させて電極を形成し、前記アノードと前記カソードを隔離するようにイオン伝導性物質を配置し、ここで、前記電極の何れか一方が前記酵素結晶固定化電極として構成するバイオ電池の製造方法。

【請求項21】
 
前記アノードを、前記酵素結晶固定化電極として構成する請求項3~5、及び12~14の何れか一項に記載のバイオ電池を製造するための請求項20に記載のバイオ電池の製造方法。

【請求項22】
 
前記カソードを、前記酵素結晶固定化電極として構成する請求項6~8、及び15~17の何れか一項に記載のバイオ電池を製造するための請求項20に記載のバイオ電池の製造方法。

【請求項23】
 
外部回路に接続可能な導電性基材と、電極触媒として酵素結晶を備え、前記酵素結晶が前記導電性基材に固定化された酵素結晶固定化電極を備えるバイオセンサー。

【請求項24】
 
外部回路に接続可能な導電性基材に電極触媒として酵素結晶を固定化した酵素結晶固定化電極を備えるバイオセンサーであって、
前記酵素結晶固定化電極が、酵素溶液からの酵素の結晶化を前記導電性基材上で行って前記導電性基材に酵素結晶を固定化することにより製造される請求項23に記載のバイオセンサー。
IPC(International Patent Classification)
State of application right Registered
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