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METHOD FOR ANALYZING GLYCAN STRUCTURE achieved foreign

Patent code P190016280
File No. 08077
Posted date Aug 21, 2019
Application number P2013-185373
Publication number P2014-066704A
Patent number P6222630
Date of filing Sep 6, 2013
Date of publication of application Apr 17, 2014
Date of registration Oct 13, 2017
Priority data
  • P2012-197908 (Sep 7, 2012) JP
Inventor
  • (In Japanese)植田 幸嗣
  • (In Japanese)遠山 敦彦
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人理化学研究所
  • (In Japanese)株式会社島津製作所
Title METHOD FOR ANALYZING GLYCAN STRUCTURE achieved foreign
Abstract Highthroughput glycan structure profiling on protein drugs by Erexim technology
Outline of related art and contending technology (In Japanese)全世界で300億ドルもの販売がなされている治療用抗体における特許の存続期間の満了を見越して、どのようにすればその生物学的類似代替物がFDAに認可されるのかについて、興味が高まりつつある。これに関し、生物学的類似物の評価に関する手引きの最初の草案が、2012年2月に米国食品医薬品局(FDA)から発行された。その中で強調されていたことは、生物医薬品の有効性および安全性に大きく影響を及ぼし得るわずかな構造(とりわけ糖付加パターン)の相違を評価することの重要性、ならびに、ロット間でのばらつきを理解するために、複数のロットを用いて構造解析を実施すべきという点であ
る。

治療用抗体に関しては、重鎖の保存領域(Fc)にあるAsn297においてN-グリコシル化がなされる共通配列が存在し、N-グリコシル化の特定の構造は治療用抗体の有効性および安全性に影響を及ぼすことが知られている。例えば、コア構造においてフコース付加がない場合、抗体依存性細胞毒性が10倍に高まることが示されている。さらに、近年の研究によれば、グリコリルノイラミン酸(Neu5Gc)およびガラクトース-α1,3-ガラクトース(α-Galエピトープ)等の非ヒトオリゴ糖モチーフは免疫原性であり、特定のIgEを発現している患者においてはアナフィラキシーを引き起こし得ることが明らかになっている。さらなる研究によれば、α-Galエピトープの免疫原性は、主として、抗原結合領域(Fab)内に生じる余分なN-グリカンによるものであることが明らかになっている。これらのことに鑑み、抗体における糖付加の不均質性およびその生物学的影響を広範囲に調べる必要がある。

ここで、糖タンパク質の糖鎖について説明すると、糖タンパク質の糖鎖は、アスパラギン残基に糖鎖が結合するN-グリコシド結合糖鎖(N型糖鎖)、ならびにセリンおよびスレオニン等と結合するO-グリコシド結合糖鎖(O型糖鎖)の2種類に大別される。N型糖鎖は以下の構造式に示す共通のコア構造を有しており、アスパラギンと結合する末端は還元末端、反対側の末端は非還元末端と呼ばれている。

【化1】
(省略)

N型糖鎖には、コア構造の非還元末端にマンノースが複数結合するハイマンノース型、非還元末端にN-アセチルグルコサミン(以下GlcNAcという)の枝を1つまたは複数本有し、さらにそれぞれの枝にガラクトース、シアル酸およびフコース等が結合した構造を有するコンプレックス型、ならびにハイマンノース型およびコンプレックス型の両方の枝をもつハイブリッド型がある。コンプレックス型およびハイブリッド型については、コア構造の分岐点となるマンノースにGlcNAcが結合し得ること(バイセクティングGlcNAc)、および還元末端のGlcNAcにフコースが結合し得ること(コアフコース)等がよく知られている。

これらの構造多様性は、単一の糖タンパク質においても観測され、Glycoform Heterogeneity等と呼ばれる。例として、N型糖鎖結合部位を1箇所有するヒト血清中免疫グロブリンGの糖鎖構造の解析からは、34種類もの糖鎖構造が存在することが報告されている(非特許文献1)。

糖タンパク質において糖鎖構造の違いがその機能に大きく影響を及ぼすことが、上述の通り近年明らかになっており(例えば、非特許文献2)、多様性のある糖鎖構造を定量的に分析し、どの構造がどの割合で含まれるのかを高効率にプロファイルする方法が求められている。

糖鎖構造を解析する方法としては、糖タンパク質から化学的あるいは酵素的にN型糖鎖を遊離させ、化学修飾(ラベル化)を施し精製したうえで、HPLCおよびMALDI-TOF MS等の質量分析法を組み合わせて検出する方法がある。この方法は、ラベル化糖鎖が逆相または順相HPLCにより構造ごとに分離しやすいこと、精製により夾雑物が除かれて高感度で測定できる等のメリットがある一方、前処理が煩雑であること、糖タン
パク質に複数の糖鎖付加部位がある場合に、糖鎖付加部位ごとの情報を得ることができない等のデメリットがある。

一方で、糖タンパク質をトリプシン等の酵素により断片化し、断片化されたペプチドに糖鎖が結合した糖ペプチドの状態で測定に供する方法が試されている(特許文献1)。このとき測定に用いられるのは主にナノHPLC-ESIをイオン源にした質量分析計であり、糖ペプチド由来のシグナルを積算し定量するほか、MSn測定による糖鎖付加部位の決定および糖鎖構造の推定も可能である。また、三連四重極型の質量分析計を用いることで、糖ペプチドごとに特異的な開裂イオンをマルチプルリアクションモニタリング(MRM)法にて定量性よく測定する方法も報告されている(非特許文献3)。
Field of industrial application (In Japanese)本発明は、糖鎖構造の解析方法に関し、詳細には、三連四重極質量分析測定による糖鎖構造の解析方法に関する。
Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
糖鎖を有する試料における糖鎖構造の解析方法において、
CIDエネルギーの値を変化させながらMS/MS測定を行う工程であって、上記試料の特定のプロダクトイオンを、CIDエネルギーの各値において測定する測定工程と、
上記特定のプロダクトイオンのそれぞれにおけるCIDエネルギーと測定量との関係を表す収量曲線を含む、エネルギー分解プロファイルを作成する作成工程と、
糖鎖を有する構造既知の参照試料における、上記特定のプロダクトイオンと同種のプロダクトイオンの測定量と、CIDエネルギーとの関係を表す収量曲線を含む、参照プロファイルを準備する準備工程と、
上記作成工程により得られた上記エネルギー分解プロファイルを上記参照プロファイルと比較することにより、上記試料の糖鎖構造を同定する同定工程とを含み、
上記特定のプロダクトイオンは、プロトン化した単糖または二糖に由来する、少なくとも2種のプロダクトイオンを含み、
上記特定のプロダクトイオンは、m/zがそれぞれ163、204、274および366であるプロダクトイオンを含み、
上記測定工程では、Low-mass cutoffが生じない質量分析装置を用いてMS/MS測定を行うことを特徴とする糖鎖構造の解析方法。

【請求項2】
 
上記特定のプロダクトイオンは、m/zが138であるプロダクトイオンをさらに含み

上記作成工程では、m/zが138である上記プロダクトイオンの測定量を用いて各収量曲線を標準化して、上記エネルギー分解プロファイルを作成することを特徴とする請求項1に記載の糖鎖構造の解析方法。

【請求項3】
 
上記試料には、濃度が既知である、糖鎖を有する標準試料が添加されており、
上記特定のプロダクトイオンは、m/zが138であるプロダクトイオンをさらに含み、
上記試料におけるm/zが138である上記プロダクトイオンの測定量と、上記標準試料におけるm/zが138である上記プロダクトイオンの測定量との比較により、上記試料の定量を行う定量工程をさらに含むことを特徴とする請求項1または2に記載の糖鎖構造の解析方法。

【請求項4】
 
上記定量工程では、m/zが138である上記プロダクトイオンの上記測定量が最大となるCIDエネルギーにおける、上記試料および上記標準試料それぞれの、m/zが138であるプロダクトイオンの上記測定量に基づき、上記試料の定量を行うことを特徴とする請求項3に記載の糖鎖構造の解析方法。

【請求項5】
 
上記最大となるCIDエネルギーの値は、糖鎖を有する複数の試料について、m/zが138であるプロダクトイオンをCIDエネルギーの値を変化させながらMS/MS測定により予め測定し、その測定量が最大となるCIDエネルギーの値と、該試料のプレカーサーイオンのm/zの値とを用いて線形回帰分析により作成された検量線から、解析対象である上記試料のプレカーサーイオンのm/zの値に基づき推定される値であることを特徴とする請求項4に記載の糖鎖構造の解析方法。

【請求項6】
 
上記測定工程では、三連四重極質量分析計を用いてMS/MS測定を行うことを特徴とする請求項1~5の何れか1項に記載の糖鎖構造の解析方法。

【請求項7】
 
上記試料は、糖ペプチドであることを特徴とする請求項1~6の何れか1項に記載の糖鎖構造の解析方法。

【請求項8】
 
上記糖ペプチドは、N型糖鎖を有する糖ペプチドであることを特徴とする請求項7に記載の糖鎖構造の解析方法。

【請求項9】
 
上記糖ペプチドは、O型糖鎖を有する糖ペプチドであることを特徴とする請求項7に記載の糖鎖構造の解析方法。
IPC(International Patent Classification)
Drawing

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State of application right Registered
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