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OPTICAL MICROSCOPE SYSTEM AND SCREENING DEVICE NEW_EN

Patent code P190016295
File No. 08289
Posted date Aug 23, 2019
Application number P2014-113244
Publication number P2015-227940A
Patent number P6395251
Date of filing May 30, 2014
Date of publication of application Dec 17, 2015
Date of registration Sep 7, 2018
Inventor
  • (In Japanese)柳田 敏雄
  • (In Japanese)上田 昌宏
  • (In Japanese)佐甲 靖志
  • (In Japanese)廣島 通夫
  • (In Japanese)小塚 淳
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人理化学研究所
Title OPTICAL MICROSCOPE SYSTEM AND SCREENING DEVICE NEW_EN
Abstract (In Japanese)
【課題】
 生体細胞1分子の動態測定をスクリーニング測定が可能な程度に高速化、自動化された光学顕微鏡システムとスクリーニング装置を得る。
【解決手段】
 蛍光性指標を励起発光させる励起光43を測定対象物1に照射する光源21と、励起光により励起された蛍光性指標の拡大された光像を得ることができる拡大光学系30と、拡大光学系で得られた測定対象物の光像46を撮像して撮像画像データを得る撮像装置31と、拡大光学系のフォーカス位置を調整するフォーカス制御部とを有する光学顕微鏡20と、撮像画像データから測定対象となる細胞を選別し、選別された測定対象である細胞に対して蛍光性指標の観測を行い、生体細胞内の1分子の動態を計測する解析部50とを備える。
【選択図】
 図1
Outline of related art and contending technology (In Japanese)光学顕微鏡とその周辺装置は、さまざまな分野での研究に貢献しているが、近年は特に測定対象物を撮像装置により撮像する機能を備え、撮像した静止画像や動画像の画像データをコンピュータや大型モニタなどの外部機器に送出して、画像解析や現象解析に供されるようになっている。また、光学顕微鏡により取得された画像を解析する解析手段が組み合わされることで、光学顕微鏡単体では把握不可能な、可視光域では数百ナノメートルオーダーである光の回折限界サイズ以下の微細な対象物を測定できる光学顕微鏡システムも実用化されている。

例えば、生命科学研究の分野では、高解像度の光学顕微鏡を用いて細胞内部の微細構造の変化や細胞分化パターンの解析など行うために、蛍光性物質を標識として用いて、その分布状況や位置の変化を測定することが行われている。生命科学研究分野における高解像度顕微鏡を用いた測定方法として、1分子蛍光追跡技術などが知られている。

1分子蛍光追跡技術は、モータータンパク質や膜タンパク分子の動態などを、細胞の1分子ずつ測定する方法である。測定対象の分子を蛍光性指標で標識し、全反射照明蛍光顕微鏡などの背景光の小さい顕微鏡法により測定することで、分子の輝点の動きを動画として把握することができる。また、動画として得られた各フレームの画像に対して、ガウスフィット法などを用いた画像処理を行って輝点の位置を特定する作業を経ることで、数ミリ~数十ミリ秒の分解能で分子のナノメートルレベルでの動態を追跡することができる(非特許文献1参照)。
Field of industrial application (In Japanese)本開示は、蛍光性指標を用いて生体細胞における1つの分子の動態計測が可能な光学顕微鏡システム、および、この光学顕微鏡システムを用いて複数のウェル内の生体細胞に対しての1分子動態計測を自動的に行い統計的なデータ処理が可能なスクリーニング装置に関する。
Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
蛍光性指標を励起発光させる励起光を測定対象物に照射する光源と、
前記励起光により励起された前記蛍光性指標の拡大された光像を得ることができる拡大光学系と、
前記拡大光学系で得られた前記測定対象物の光像を撮像して撮像画像データを得る撮像装置と、
前記拡大光学系のフォーカス位置を調整するフォーカス制御部とを有する光学顕微鏡と、
前記撮像画像データから測定対象となる細胞を選別し、選別された測定対象である細胞に対して前記蛍光性指標の観測を行い、生体細胞内の1分子の動態を計測する解析部とを備え、
前記解析部が、透過光による前記測定対象物の光像から得られた撮像画像から、各ピクセルについての分散値/平均値画像であるCV画像を作成し、得られた前記CV画像に対して二値化処理を行って前記測定対象となる細胞の選別を行い、
さらに、前記解析部は、前記透過光による前記測定対象物の光像を取得する際に、前記フォーカス制御部を制御して、デフォーカス状態の撮像画像を含む複数の撮像画像を取得し、取得した複数の前記撮像画像の合成画像に基づいて前記測定対象となる細胞の選別を行う、光学顕微鏡システム。

【請求項2】
 
蛍光性指標を励起発光させる励起光を測定対象物に照射する光源と、
前記励起光により励起された前記蛍光性指標の拡大された光像を得ることができる拡大光学系と、
前記拡大光学系で得られた前記測定対象物の光像を撮像して撮像画像データを得る撮像装置と、
前記拡大光学系のフォーカス位置を調整するフォーカス制御部とを有する光学顕微鏡と、
前記撮像画像データから測定対象となる細胞を選別し、選別された測定対象である細胞に対して前記蛍光性指標の観測を行い、生体細胞内の1分子の動態を計測する解析部とを備え、
前記解析部が、同一の測定対象物についての全反射照明下における撮像画像と対物レンズの光軸上からの落射照明下における撮像画像とを取得し、これら2つの撮像画像の相関係数に基づいて当該撮像対象物の発現状態を判断する、光学顕微鏡システム。

【請求項3】
 
蛍光性指標を励起発光させる励起光を測定対象物に照射する光源と、
前記励起光により励起された前記蛍光性指標の拡大された光像を得ることができる拡大光学系と、
前記拡大光学系で得られた前記測定対象物の光像を撮像して撮像画像データを得る撮像装置と、
前記拡大光学系のフォーカス位置を調整するフォーカス制御部とを有する光学顕微鏡と、
前記撮像画像データから測定対象となる細胞を選別し、選別された測定対象である細胞に対して前記蛍光性指標の観測を行い、生体細胞内の1分子の動態を計測する解析部とを備え、
前記光学顕微鏡は、前記励起光を照射する照射光学系において、前記拡大光学系の対物レンズにおける焦点位置と共役点となる位置に配置された、前記励起光の少なくとも一部を遮蔽する遮蔽部材を備え、
前記解析部が、前記遮蔽部材の光像の輝度分布をガウス分布でフィッティングした統計量からコントラスト値を算出し、前記コントラスト値が最も大きくなる位置を前記対物レンズのフォーカス位置であると判断し、前記フォーカス制御部により前記光学顕微鏡のオートフォーカス動作が行われる、光学顕微鏡システム。

【請求項4】
 
蛍光性指標を励起発光させる励起光を測定対象物に照射する光源と、
前記励起光により励起された前記蛍光性指標の拡大された光像を得ることができる拡大光学系と、
前記拡大光学系で得られた前記測定対象物の光像を撮像して撮像画像データを得る撮像装置と、
前記拡大光学系のフォーカス位置を調整するフォーカス制御部とを有する光学顕微鏡と、
前記撮像画像データから測定対象となる細胞を選別し、選別された測定対象である細胞に対して前記蛍光性指標の観測を行い、生体細胞内の1分子の動態を計測する解析部とを備え、
前記解析部が、透過光による前記測定対象物の光像から得られた撮像画像から、各ピクセルについての分散値/平均値画像であるCV画像を作成し、得られた前記CV画像に対して二値化処理を行って前記測定対象となる細胞の選別を行う、光学顕微鏡システム。

【請求項5】
 
前記光学顕微鏡は、前記励起光を照射する照射光学系において、前記拡大光学系の対物レンズにおける焦点位置と共役点となる位置に配置された、前記励起光の少なくとも一部を遮蔽する遮蔽部材を備え、
前記解析部が、前記遮蔽部材の光像に基づいて前記対物レンズのフォーカス位置を判断
し、前記フォーカス制御部により前記光学顕微鏡のオートフォーカス動作が行われる請求項1、2、および4のいずれかに記載の光学顕微鏡システム。

【請求項6】
 
前記照射光学系が、全反射照明と対物レンズの光軸上からの落射照明との2つの照射方法での前記測定対象物の照射が可能であり、前記遮蔽物の光像に基づく前記光学顕微鏡のオートフォーカス動作を前記対物レンズの光軸上からの落射照明下で行い、前記測定対象物の1つの蛍光指標の動態測定のための撮像画像の取得を、全反射照明下で行う、請求項3または5に記載の光学顕微鏡システム。

【請求項7】
 
前記解析部が、前記撮像画像に対して二値化処理を行って前記撮像画像の二値化情報を取得し、前記二値化情報を用いて前記撮像画像における前記遮蔽部材の境界部分のコントラストを数値化して、前記数値化されたコントラスト値が最も大きくなる位置が前記拡大光学系におけるフォーカス位置であると判断し、前記拡大光学系におけるオートフォーカス動作が行われる、請求項3、5、および6のいずれかに記載の光学顕微鏡システム。

【請求項8】
 
前記解析部が、測定視野内に配置された、少なくとも一方向において規則性を有する光学パターンを撮像した前記撮像画像から、前記撮像画像の所定範囲内での前記光学パターンの位置間隔を求め、得られた位置間隔の平均値を用いて撮像倍率情報を取得する請求項1~7のいずれかに記載の光学顕微鏡システム。

【請求項9】
 
前記解析部が、前記撮像画像の所定範囲内での前記光学パターンの位置間隔から前記撮像画像における二次元の座標位置を特定し、前記特定された二次元の座標位置から、複数の撮像画像を並べて配置した撮像画像を取得する、請求項8に記載の光学顕微鏡システム。

【請求項10】
 
前記光学顕微鏡は、光学的分光手段と前記光学的分光手段で分光されて得られた波長の異なる複数種類の光像それぞれからの撮像画像を取得可能な複数の撮像光学系を備え、
前記解析部は、測定視野内に配置された、少なくとも一方向において規則性を有する光学パターンを撮像して得られた前記複数の撮像光学系による撮像画像を用いて、各撮像光学系による前記撮像画像間の位置情報の誤差を補正する補正値を取得し、
前記補正値を用いて前記複数の撮像光学系により得られた撮像画像の誤差を補正する請求項1~9のいずれかに記載の光学顕微鏡システム。

【請求項11】
 
前記解析部が、透過光による前記測定対象物の光像から得られた撮像画像から、各ピクセルについての分散値/平均値画像であるCV画像を作成し、得られた前記CV画像に対して二値化処理を行って前記測定対象となる細胞の選別を行う、請求項2または3に記載の光学顕微鏡システム。

【請求項12】
 
前記解析部は、前記透過光による前記測定対象物の光像を取得する際に、前記フォーカス制御部を制御して、デフォーカス状態の撮像画像を含む複数の撮像画像を取得し、取得した複数の前記撮像画像の合成画像に基づいて前記測定対象となる細胞の選別を行う、請求項4または11に記載の光学顕微鏡システム。

【請求項13】
 
前記解析部が、同一の測定対象物についての全反射照明下における撮像画像と対物レンズの光軸上からの落射照明下における撮像画像とを取得し、これら2つの撮像画像の相関係数に基づいて当該撮像対象物の発現状態を判断する、請求項1、3、および4のいずれかに記載の光学顕微鏡システム。

【請求項14】
 
前記請求項1~請求項13のいずれかに記載された光学顕微鏡システムと、
それぞれに被測定物を収容可能な複数個のウェルを有するウェルプレートを移送し、各
ウェルを順次前記拡大光学系の対物レンズ視野に配置可能なウェル移送手段と、
前記ウェル移送手段を制御して、それぞれのウェル内の測定対象物における生体細胞1分子の動態を計測するスクリーニング制御部とを備え、
各ウェル内に位置する複数の測定対象物における生体細胞1分子の自動スクリーニングを可能とする、スクリーニング装置。

【請求項15】
 
蛍光性指標を励起発光させる励起光を測定対象物に照射する光源と、
前記励起光により励起された前記蛍光性指標の拡大された光像を得ることができる拡大光学系と、
前記拡大光学系で得られた前記測定対象物の光像を撮像して撮像画像データを得る撮像装置と、
前記拡大光学系のフォーカス位置を調整するフォーカス制御部とを有する光学顕微鏡と、
前記撮像画像データから測定対象となる細胞を選別し、選別された測定対象である細胞に対して前記蛍光性指標の観測を行い、生体細胞内の1分子の動態を計測する解析部とを備えた光学顕微鏡システムと、
それぞれに被測定物を収容可能な複数個のウェルを有するウェルプレートを移送し、各ウェルを順次前記拡大光学系の対物レンズ視野に配置可能なウェル移送手段と、
前記ウェル移送手段を制御して、それぞれのウェル内の測定対象物における生体細胞1分子の動態を計測するスクリーニング制御部と、
前記ウェルと前記拡大光学系の対物レンズとの間の油浸オイルを供給するオイル供給装置と、
前記ウェルと前記拡大光学系の対物レンズとの間に配置され前記拡大光学系の対物レンズの光軸の部分に開口部が形成されたオイルアダプタとを備え、
前記オイル供給装置は、前記油浸オイルを供給する一系統のオイル供給系と、前記油浸オイルを排出する二系統のオイル排出系を有し、前記二系統のオイル排出系のうち少なくとも一系統が前記油浸オイルを吸引排出するオイル排出系であり、
前記オイルアダプタは、
前記油浸オイルを前記オイルアダプタと前記対物レンズとの間の間隙部に供給する前記オイル供給系に接続されたオイル供給ケーブルと、
前記供給され、前記開口部から染み出した油浸オイルを前記オイルアダプタの上面側から吸引排出する前記オイル排出系に接続されたオイル吸引ケーブルと、
前記オイルアダプタの周辺部分に形成された溝部内の前記油浸オイルを排出する前記溝部の底面に形成されたオイル排出ケーブルとを備え、
各ウェル内に位置する複数の測定対象物における生体細胞1分子の自動スクリーニングを可能とする、スクリーニング装置。

【請求項16】
 
前記スクリーニング制御部は、前記光学顕微鏡から得られる前記撮像画像に基づいて、前記ウェルプレートが有する複数のウェルの中心位置を予め認識してウェル中心情報を取得し、前記ウェル中心情報に基づいて前記ウェル移送手段を制御する請求項14または15に記載のスクリーニング装置。

【請求項17】
 
前記ウェル内の前記測定対象物それぞれに、所定のタイミングで異なる刺激を与えることができる測定環境制御手段をさらに備える請求項14~16のいずれかに記載のスクリーニング装置。

【請求項18】
 
ウェルと拡大光学系の対物レンズとの間に配置され、前記拡大光学系の対物レンズの光軸の部分に開口部が形成されたオイルアダプタであって、
油浸オイルを前記オイルアダプタと前記対物レンズとの間の間隙部に供給するオイル供給系に接続されたオイル供給ケーブルと、
前記供給され、前記開口部から染み出した油浸オイルを前記オイルアダプタの上面側から吸引排出するオイル排出系に接続されたオイル吸引ケーブルと、
前記オイルアダプタの周辺部分に形成された溝部内の前記油浸オイルを排出する前記溝部の底面に形成されたオイル排出ケーブルとを備えた、オイルアダプタ。
IPC(International Patent Classification)
Drawing

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thum_JPA 427227940_i_000002.jpg
State of application right Registered
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