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(In Japanese)データ作成方法及びデータ使用方法 meetings

Patent code P190016495
File No. (S2017-0202-N0)
Posted date Nov 25, 2019
Application number P2018-513685
Patent number P6422616
Date of filing Dec 22, 2017
Date of registration Oct 26, 2018
International application number JP2017047414
Date of international filing Dec 22, 2017
Priority data
  • P2016-249896 (Dec 22, 2016) JP
Inventor
  • (In Japanese)野村 暢彦
  • (In Japanese)八幡 穣
  • (In Japanese)清川 達則
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人筑波大学
Title (In Japanese)データ作成方法及びデータ使用方法 meetings
Abstract (In Japanese)データ作成方法は、所定の波長の光の焦点を所定の焦点面上の1つの座標に配置して、該座標に位置する試料に光からなる励起光を照射することによって、試料由来の自家蛍光を取得して、自家蛍光の強度データ及び/又はスペクトルデータを含む自家蛍光データを生成する自家蛍光データ生成ステップと、所定の焦点面上の1つの座標に照射光を照射することによって、試料が散乱させた反射光を取得し、該反射光の強度データを生成する反射光データ生成ステップと、所定の焦点面上の1つの座標における自家蛍光データと、反射光データとを対応付けた対応データを作成する対応データ作成ステップとを含む。
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

従来、微生物種の同定を行う際には、コッホの法則で体系化されたように、検体から微生物を単離して培養するのが一般的である。これに対して、微生物の単離や培養を行わずに微生物種を同定する技術として、次世代シークエンサー技術に基づいたメタゲノム解析によって微生物種を同定する種別同定方法が提案されている(例えば、特許文献1を参照)。特許文献1によれば、メタゲノム解析によって決定された塩基配列と、既知の微生物の塩基配列とを比較することによって、検体中に存在する微生物の微生物種を同定することができる。

このほかに微生物種を同定する技術として、コロニーが発する自家蛍光を検出することによって微生物種の同定を行う方法が知られている(例えば、特許文献2、3を参照)。特許文献2、3によれば、微生物に対して非侵襲で微生物種を検出することができる。さらに、蛍光染色された細胞に励起光を照射することによって該細胞が発する蛍光を撮像して得られる撮像画像であって、波長帯域が異なる励起光に基づく複数の撮像画像を用いて細胞を検出する技術が知られている(例えば、特許文献4を参照)。

近年、微生物の動態を探るため、共焦点顕微鏡を用いて三次元空間における微生物の位置やその空間における動きを把握する研究が行われている(例えば、非特許文献1、2を参照)。これらの研究は、例えば微生物集団と微生物によって生産される細胞外マトリクス成分の複合体(バイオフィルム)の形成過程を経時的三次元的に観察することにおいて大きな成果をあげてきたが、当該方法を自家蛍光に基づく微生物の同定・評価に応用するという着想は報告されていない。また、前述の特許文献1~4において、三次元空間における空間的な位置やその空間における動きを把握するといった、微生物種の同定に加え、非侵襲の微生物の位置情報を取得することについては考慮されていない。さらには、空間上の1つの座標における、試料の発する自家蛍光と反射光の両者を対応させて記録するという着想は、前記の先行技術文献に記載も示唆もない。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、例えば微生物が発した自家蛍光を測定することによってデータを作成するデータ作成方法、及びそのデータを使用するデータ使用方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
共焦点顕微鏡を用いて試料を同定又は評価するためのデータを作成するデータ作成方法において、
前記共焦点顕微鏡の光学系を経由して出射される所定の波長の励起光の焦点を、前記共焦点顕微鏡によって走査する三次元空間における所定の面上の1つの座標に配置して、該座標に位置する試料に前記励起光を照射することによって、該励起光を照射した座標における試料由来の自家蛍光を取得する処理を、前記所定の平面上の互いに異なる複数の座標において実施して、該所定の平面における各座標の自家蛍光の強度データ及び/又はスペクトルデータを含む自家蛍光データを生成する自家蛍光データ生成ステップと、
前記所定の面上の1つの座標に、前記共焦点顕微鏡の光学系を経由して出射される照射光を照射することによって、該照射光を照射した座標において前記試料が散乱させた反射光を取得する処理を、前記所定の平面上の互いに異なる複数の座標において実施し、該所定の平面における各座標の反射光の強度データを生成する反射光データ生成ステップと、
前記所定の面上の座標における前記自家蛍光データと、前記反射光の強度データとを対応付けた対応データを作成する対応データ作成ステップと
互いに異なる平面において、前記自家蛍光データ生成ステップ、前記反射光データ生成ステップ、及び前記対応データ作成ステップを繰り返す繰り返しステップとを含む、
データ作成方法。

【請求項2】
 
前記自家蛍光データ生成ステップにおいて、波長の異なる複数の励起光の照射を実施し、該複数の励起光により得られた各自家蛍光の前記スペクトルデータにより構成されるスペクトルプロファイルデータを含む前記自家蛍光データを作成する、
請求項1に記載のデータ作成方法。

【請求項3】
 
前記反射光データ生成ステップは、前記波長の異なる複数の励起光のいずれかの励起光を用いて前記反射光を取得する、
請求項2に記載のデータ作成方法。

【請求項4】
 
前記反射光データ生成ステップは、前記波長の異なる複数の励起光のすべての励起光を用いて前記反射光を取得する、
請求項2に記載のデータ作成方法。

【請求項5】
 
前記自家蛍光データ生成ステップは、前記反射光データ生成ステップにおいて所定の強度以上の反射光が得られた座標においてのみ実施する、
請求項1~4のいずれかに記載のデータ作成方法。

【請求項6】
 
前記自家蛍光データ生成ステップは、前記反射光データ生成ステップにおいて所定の強度以上の反射光が得られた複数の座標と、該複数の座標によって取り囲まれる領域であって、前記試料の内部に相当する領域の内部に位置する一つ又は複数の座標とにおいて実施する、
請求項1~4のいずれかに記載のデータ作成方法。

【請求項7】
 
前記励起光及び前記照射光は、少なくとも一方がレーザ光である、
請求項1~6のいずれかに記載のデータ作成方法。

【請求項8】
 
請求項1~7のいずれかに記載のデータ作成方法によって前記対応データを生成し、複数の試料の自家蛍光データを比較することによって、試料の状態との相関を見出すデータ使用方法。

【請求項9】
 
機械学習により前記相関が見出されるものである、請求項8に記載のデータ使用方法。

【請求項10】
 
請求項1~7のいずれかに記載のデータ作成方法によって前記対応データを生成し、既知試料の自家蛍光データと未知試料の自家蛍光データとを比較することによって、未知試料の同定又は評価を行うデータ使用方法。

【請求項11】
 
機械学習により既知試料の特徴付けが行われるものである、請求項10に記載のデータ使用方法。

【請求項12】
 
試料が、動物細胞、植物細胞、酵母細胞、真菌類細胞、微細藻類細胞、細菌類、古細菌類、ウイルス、ファージのいずれか及びそれらが産生する胞子、芽胞、膜小胞のいずれかである請求項811のいずれかに記載のデータ使用方法。

【請求項13】
 
前記試料の状態が、試料の代謝状態又は生理状態に関するものである請求項8又は9に記載のデータ使用方法。

【請求項14】
 
前記未知試料の同定が、生物学上の分類菌の病原型又は菌の抗原型を同定するものである請求項10又は11に記載のデータ使用方法。

【請求項15】
 
前記未知試料の同定が、微生物学上の株又は亜株である請求項10又は11に記載のデータ使用方法。

【請求項16】
 
前記未知試料の評価が、代謝状態又は生理状態に関するものである請求項10又は11に記載のデータ使用方法。

【請求項17】
 
共焦点顕微鏡を用いて試料を同定又は評価するために作成されたデータを使用するデータ使用方法において、
前記共焦点顕微鏡の光学系を経由して出射される所定の波長の励起光の焦点を、前記共焦点顕微鏡によって走査する三次元空間における所定の面上の1つの座標に配置して、該座標に位置する試料に前記励起光を照射することによって、該励起光を照射した座標における試料由来の自家蛍光を取得する処理を、前記所定の平面上の互いに異なる複数の座標において実施して、該所定の平面における各座標の自家蛍光の強度データ及び/又はスペクトルデータを含む自家蛍光データを生成する自家蛍光データ生成ステップと、
前記所定の面上の1つの座標に、前記共焦点顕微鏡の光学系を経由して出射される照射光を照射することによって、該照射光を照射した座標において前記試料が散乱させた反射光を取得する処理を、前記所定の平面上の互いに異なる複数の座標において実施し、該所定の平面における各座標の反射光の強度データを生成する反射光データ生成ステップと、
前記所定の面上の座標における前記自家蛍光データと、前記反射光の強度データとを対応付けた対応データを作成する対応データ作成ステップと
前記自家蛍光データ生成ステップ、反射光データ生成ステップ、及び対応データ作成ステップを互いに異なる複数の面において繰り返す繰り返しステップと、
前記繰り返しステップにより得られた前記対応データを用いて、所定の特性を有する集団を抽出する抽出ステップとを含む、
データ使用方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
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