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(In Japanese)真菌におけるタンパク質の選択的分泌技術

Patent code P200016548
File No. (S2017-0213-N0)
Posted date Jan 15, 2020
Application number P2018-559146
Date of filing Dec 22, 2017
International application number JP2017046107
International publication number WO2018123856
Date of international filing Dec 22, 2017
Date of international publication Jul 5, 2018
Priority data
  • P2016-252330 (Dec 27, 2016) JP
Inventor
  • (In Japanese)玉置 尚▲徳▼
  • (In Japanese)二神 泰基
  • (In Japanese)岩元 正孝
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人鹿児島大学
  • (In Japanese)カクイ株式会社
Title (In Japanese)真菌におけるタンパク質の選択的分泌技術
Abstract (In Japanese)本発明は、望ましくない酵素の量が低減された培養上清を簡便に得るための方法、該方法に用いられ得る微生物、及び該微生物を用いて目的の物質を生産する方法等を提供すること等を目的とする。
本発明は、内在性分泌酵素をコードするポリヌクレオチドに、GPI付加シグナル配列をコードするポリヌクレオチドが連結された融合ポリヌクレオチドを発現する改変真菌、及び該改変真菌を用いて目的の物質を生産する方法等に関する。
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

真菌、特に糸状菌は多種多様な酵素を分泌生産するため、その培養上清が酵素製剤として使用されている。しかしながら、真菌の培養上清を酵素製剤として使用する場合には、真菌由来の望ましくない酵素、例えば目的物質を分解する活性を有する酵素の混入が問題となる。培養上清から望ましくない酵素を除去するには、精製又は分離プロセス等が必要になるため、真菌由来の酵素製剤には、コストが高く、生産量が一定せず安定供給が難しいという2つの大きな問題があった。また、望ましくない酵素の量を低減する方法として、該酵素をコードする遺伝子を破壊した株を用いる方法も考えられるが、この方法では真菌の増殖性が顕著に低下する可能性がある。したがって、真菌の増殖性を顕著に損ねることなく、望ましくない酵素の量が低減された培養上清を得る方法が求められていた。

一方、GPI(グリコシルホスファチジルイノシトール)は、翻訳後修飾によってタンパク質のC末端に付加される糖脂質であり、ある種のタンパク質を細胞表面に固定化(アンカー)する機能を有する。これまでに、GPIは、酵母においてタンパク質を細胞表面にディスプレイさせるために用いることが示されているが(特許文献1)、GPIを内在性の分泌酵素に適用することは、これまでに全く考えられていなかった。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、内在性分泌酵素をコードするポリヌクレオチドに、GPI付加シグナル配列をコードするポリヌクレオチドが連結された融合ポリヌクレオチドを発現する改変真菌、及び該改変真菌を用いて目的の物質を生産する方法等に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
内在性分泌酵素をコードするポリヌクレオチドの3'末端側に、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)付加シグナル配列をコードする外来性ポリヌクレオチドが連結された融合ポリヌクレオチドを発現し、それによって、前記分泌酵素がGPIにより細胞表面に固定されたことを特徴とする改変真菌。

【請求項2】
 
糸状菌に属する、請求項1に記載の真菌。

【請求項3】
 
Trichoderma属、Aspergillus属、Penicillium属、Monascus属、及びThermoascus属からなる群から選択される糸状菌に属する、請求項2に記載の真菌。

【請求項4】
 
Trichoderma reesei種に属する、請求項3に記載の真菌。

【請求項5】
 
分泌酵素がグリコシダーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、及びヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項1~4のいずれか一項に記載の真菌。

【請求項6】
 
真菌が目的の物質の生産に用いられるものであり、目的の物質と分泌酵素が、以下の組み合わせ:
(a)目的の物質が糖であり、分泌酵素がグリコシダーゼである;
(b)目的の物質が脂質であり、分泌酵素がリパーゼである;
(c)目的の物質がタンパク質であり、分泌酵素がプロテアーゼである;及び
(d)目的の物質が核酸であり、分泌酵素がヌクレアーゼである;
からなる群から選択される、請求項1~5のいずれか一項に記載の真菌。

【請求項7】
 
目的の物質がセロビオースであり、分泌酵素がβグルコシダーゼである、請求項6に記載の真菌。

【請求項8】
 
請求項1~5のいずれか一項に記載の真菌を培地で培養する工程、及び
培養された該真菌から内在性分泌酵素の量が低減された培養上清を回収する工程
を含む、内在性分泌酵素の量が低減された真菌培養上清を生産する方法。

【請求項9】
 
原料物質を、請求項1~5のいずれか一項に記載の真菌又は請求項8に記載の真菌培養上清と接触させ、原料物質から目的の物質を生産する工程
を含む、目的の物質を生産する方法。

【請求項10】
 
目的の物質と分泌酵素が、以下の組み合わせ:
(a)目的の物質が糖であり、分泌酵素がグリコシダーゼである;
(b)目的の物質が脂質であり、分泌酵素がリパーゼである;
(c)目的の物質がタンパク質であり、分泌酵素がプロテアーゼである;及び
(d)目的の物質が核酸であり、分泌酵素がヌクレアーゼである;
請求項9に記載の方法。

【請求項11】
 
目的の物質がセロビオースであり、分泌酵素がβグルコシダーゼである、請求項10に記載の方法。

【請求項12】
 
目的の物質を回収する工程を含む、請求項9~11のいずれか一項に記載の方法。

【請求項13】
 
内在性分泌酵素をコードするポリヌクレオチドの3'末端側に、グリコシルホスファチジルイノシトール(GPI)付加シグナル配列をコードする外来性ポリヌクレオチドが連結された融合ポリヌクレオチドを発現するように真菌を改変する工程を含む、前記分泌酵素がGPIにより細胞表面に固定された改変真菌の作製方法。

【請求項14】
 
真菌がTrichoderma reesei種に属する、請求項13に記載の方法。

【請求項15】
 
分泌酵素がグリコシダーゼ、リパーゼ、プロテアーゼ、及びヌクレアーゼからなる群から選択される、請求項13又は14に記載の方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2018559146thum.jpg
State of application right Published
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