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DETERMINATION METHOD FOR DETERMINING PRESENCE OF TWO OR MORE KINDS OF SPECIFIC OLIGONUCLEOTIDE, AND METHOD FOR DETERMINING THAT TEST OBJECT IS AFFECTED BY SMALL-CELL LUNG CANCER OR BILE DUCT CANCER OR HAS RISK OF BEING AFFECTED BY SUCH CANCER BY USING THE DETERMINATION METHOD

Patent code P200016623
File No. S2018-0745-N0
Posted date Feb 25, 2020
Application number P2018-121179
Publication number P2020-000056A
Date of filing Jun 26, 2018
Date of publication of application Jan 9, 2020
Inventor
  • (In Japanese)川野 竜司
  • (In Japanese)平谷 萌恵
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人東京農工大学
Title DETERMINATION METHOD FOR DETERMINING PRESENCE OF TWO OR MORE KINDS OF SPECIFIC OLIGONUCLEOTIDE, AND METHOD FOR DETERMINING THAT TEST OBJECT IS AFFECTED BY SMALL-CELL LUNG CANCER OR BILE DUCT CANCER OR HAS RISK OF BEING AFFECTED BY SUCH CANCER BY USING THE DETERMINATION METHOD
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for simply and accurately determining the presence of two or more kinds of specific oligonucleotide.
SOLUTION: A determination method includes: a process of mixing a probe having a sequence complementary with two or more kinds of specific oligonucleotide and a measurement sample to obtain a mixture; a process of applying voltage between first solution containing the mixture and second solution which are partitioned by a lipid double membrane having a nanopore, and measuring the electric current intensity of electric current flowing between the first solution and the second solution over time to obtain electric current data over time; and a process of obtaining a plurality of interval time from the electric current data over time, performing a processing based on the central limit theorem regarding the plurality of interval time to obtain frequency distribution, identifying a content pattern derived from the two or more kinds of specific oligonucleotide on the basis of the frequency distribution, and determining the presence of each of the two or more kinds of specific oligonucleotide in the measurement sample from the content pattern.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

血液などの体液サンプルから、対象となる特定のオリゴヌクレオチド等を検出する方法として、リキッドバイオプシーが知られている。リキッドバイオプシーは、例えば、がんに罹患すると差示的に発現するマイクロRNA等の複数種のオリゴヌクレオチドを検出する方法として、着目されている。

特定のオリゴヌクレオチドを検出する技術として、ナノポア分析技術が知られている。ここで、ナノポア分析技術とは、ナノサイズの貫通孔を有するタンパク質において、該貫通孔を生体分子が通過するときに観測される電流の変化を基に、該生体分子を分析する技術である。

例えば、特許文献1及び特許文献2には、ターゲットのオリゴヌクレオチドに対して相補的な配列を含み、3′末端、5′末端もしくはそれら両末端に末端伸長部を有するプローブを用いたナノポア分析技術を基礎とするオリゴヌクレオチドの検出法、が開示されている。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、2種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無を判定する判定方法、並びに、前記判定方法を用いて検査対象が小細胞肺がん、胆管がん及び糖尿病に罹患している又はそのリスクを有することを判定する方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
(1)2種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するプローブと測定試料とを混合し混合物を得る第一の工程と、
(2)ナノポアを有する脂質二重膜により互いに隔てられる、前記混合物を含む第一の溶液と第二の溶液との間に電圧を印加し、前記第一の溶液と前記第二の溶液との間を流れる電流の電流強度を経時的に測定し電流経時変化データを得る第二の工程と、
(3-1)前記電流経時変化データからインターバル時間を複数個求め、
(3-2)前記複数個のインターバル時間について中心極限定理に基づく処理を行い度数分布を得て、
(3-3)前記度数分布を基に前記2種以上の特定オリゴヌクレオチドに由来する含有パターンを同定し、
(3-4)前記含有パターンから前記測定試料における前記2種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの有無を判定する第三の工程と、
を含む、
2種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無を判定する判定方法。

【請求項2】
 
前記プローブは、前記2種以上の特定オリゴヌクレオチドのそれぞれに相補的な配列を全て一分子中に含むプローブである、請求項1に記載の判定方法。

【請求項3】
 
前記プローブにおける前記2種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列の順番は、前記プローブと前記2種以上の特定オリゴヌクレオチドとの複合体の自由エネルギーが最も低くなるように選択されている、
請求項2に記載の判定方法。

【請求項4】
 
前記プローブは、それぞれ異なる特定オリゴヌクレオチドに相補的な2種以上のプローブからなる、請求項1に記載の判定方法。

【請求項5】
 
前記第一の工程と前記第二の工程との間に、
前記混合物をアニーリング処理する工程を含む、
請求項1~請求項4のいずれか1項に記載の判定方法。

【請求項6】
 
前記特定オリゴヌクレオチドがmiRNAであり、
前記プローブがオリゴデオキシリボヌクレオチドである、
請求項1~請求項5のいずれか1項に記載の判定方法。

【請求項7】
 
前記プローブは、ポリデオキシシトシン構造を3’末端に有する、
請求項1~請求項6のいずれか1項に記載の判定方法。

【請求項8】
 
前記プローブは、ヘアピン構造を5’末端に有する、
請求項1~請求項7のいずれか1項に記載の判定方法。

【請求項9】
 
前記第三の工程は、
前記度数分布を第一の度数分布とし、
前記2種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの有無が既知である溶液を前記測定試料として用いて、前記(3-1)及び(3-2)を行うことで得られた第二の度数分布と、前記第一の度数分布と、を比較する工程を含む、
請求項1~請求項8のいずれか1項に記載の判定方法。

【請求項10】
 
前記第三の工程は、
前記第一の度数分布を基に、前記測定試料における前記2種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの含有量を求めることを更に含む、
請求項9に記載の判定方法。

【請求項11】
 
前記第三の工程は、
前記2種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの含有量が既知である溶液を前記測定試料として用いて、前記(3-1)及び(3-2)を行うことで得られた第三の度数分布と、前記第一の度数分布と、を比較する工程を含む、
請求項10に記載の判定方法。

【請求項12】
 
CPUと、メモリと、を備え、
(3-1A)ナノポアを有する脂質二重膜により互いに隔てられる、2種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するプローブと測定試料との混合物を含む第一の溶液と第二の溶液との間に電圧を印加して得られた、前記第一の溶液と前記第二の溶液との間を流れる電流の電流強度の電流経時変化データからインターバル時間を複数個求めること、
(3-2A)前記複数個のインターバル時間について中心極限定理に基づく処理を行い度数分布を得ること、
(3-3A)前記度数分布を基に前記2種以上の特定オリゴヌクレオチドに由来する含有パターンを同定すること、
(3-4A)前記含有パターンから前記測定試料における前記2種以上の特定オリゴヌクレオチドそれぞれの有無を判定すること、
を含むプロセスにより2種以上の特定オリゴヌクレオチドの有無を判定するように構成された判定装置。

【請求項13】
 
(1)小細胞肺がんにおいて差示的に発現する又はしない2種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するプローブと検査対象に由来するサンプルとを混合し混合物を得る第一の工程と、
(2)ナノポアを有する脂質二重膜により互いに隔てられる、前記混合物を含む第一の溶液と第二の溶液との間に電圧を印加し、前記第一の溶液及び前記第二の溶液の間を流れる電流の電流強度を経時的に測定し電流経時変化データを得る第二の工程と、
(3-1)前記電流経時変化データからインターバル時間を複数個求め、
(3-2)前記複数個のインターバル時間について中心極限定理に基づく処理を行い第一の度数分布を得て、
(3-3)前記第一の度数分布と、前記サンプルの代わりに小細胞肺がんに罹患していない健常者又に由来するサンプルを用いて前記(1)~(3-2)を行うことで得られた第二の度数分布及び/又は小細胞肺がんに罹患している罹患者に由来するサンプルを用いて前記(1)~(3-2)を行うことで得られた第三の度数分布と、を比較することにより、前記検査対象が小細胞肺がんに罹患していること又はそのリスクを有することを判定する第三の工程と、を含む、
検査対象が小細胞肺がんに罹患していること又はそのリスクを有することを判定する方法。

【請求項14】
 
(1)胆管がんにおいて差示的に発現する又はしない2種以上の特定オリゴヌクレオチドに相補的な配列を有するプローブと検査対象に由来するサンプルとを混合し混合物を得る第一の工程と、
(2)ナノポアを有する脂質二重膜により互いに隔てられる、前記混合物を含む第一の溶液と第二の溶液との間に電圧を印加し、前記第一の溶液及び前記第二の溶液の間を流れる電流の電流強度を経時的に測定し電流経時変化データを得る第二の工程と、
(3-1)前記電流経時変化データからインターバル時間を複数個求め、
(3-2)前記複数個のインターバル時間について中心極限定理に基づく処理を行い第一の度数分布を得て、
(3-3)前記第一の度数分布と、前記サンプルの代わりに胆管がんに罹患していない健常者又に由来するサンプルを用いて前記(1)~(3-2)を行うことで得られた第二の度数分布及び/又は胆管がんに罹患している罹患者に由来するサンプルを用いて前記(1)~(3-2)を行うことで得られた第三の度数分布と、を比較することにより、前記検査対象が胆管がんに罹患していること又はそのリスクを有することを判定する第三の工程と、を含む、
検査対象が胆管がんに罹患していること又はそのリスクを有することを判定する方法。

【請求項15】
 
配列番号8の塩基配列を有するプローブ。

【請求項16】
 
配列番号9の塩基配列を有するプローブと、配列番号10の塩基配列を有するプローブと、を含む、プローブセット。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2018121179thum.jpg
State of application right Published
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