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原核生物用発現ベクター

国内特許コード	P200016657
整理番号	Ｈ30-009
掲載日	2020年3月2日
出願番号	特願2018-137930
公開番号	特開2020-014392
出願日	平成30年7月23日(2018.7.23)
公開日	令和2年1月30日(2020.1.30)
発明者	近藤興祐村惠彦
出願人	国立大学法人山口大学
発明の名称	原核生物用発現ベクター
発明の概要	【課題】翻訳促進効果のある配列を発現対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの非翻訳領域に含むように設計された原核生物用発現ベクターの提供。【解決手段】（１）特定の４８３の塩基を有するミオシン調節軽鎖（ｍｙｏｓｉｎｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｌｉｇｈｔｃｈａｉｎ：ｍｌｃＲ）をコードするポリヌクレオチドの全長又は部分配列であって、前記塩基配列の少なくとも４７４～４８３番目の塩基配列を含むポリヌクレオチド；（２）上記（１）記載のポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド；の（１）又は（２）記載のポリヌクレオチドと、リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドと、発現対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを順次備えた原核生物用発現ベクター。【選択図】なし
従来技術、競合技術の概要	近年の遺伝子組換え技術の進展とともに、微生物を用いて様々な有用なタンパク質の生産を行うことが行われるようになった。なかでも細菌は、アミノ酸、タンパク質等の有用物質を生産するために広く利用されている。特に近年は、医薬上・産業上有用なタンパク質の遺伝子を細菌に導入して形質転換し、かかる形質転換体を用いて有用タンパク質を効率的に生産する技術が知られるようになっている。タンパク質発現に用いる細菌として、グラム陰性菌の一種である大腸菌が汎用されている。大腸菌をタンパク質発現に利用する技術は工業用タンパク質、食品加工用タンパク質及び医薬品用タンパク質の生産にまで幅広く用いられている。大腸菌を用いたタンパク質生産において様々な発現系ベクターが開発されてきている。最も広く使われる発現系ベクターはｐＥＴ発現系ベクター（非特許文献１参照）である。ｐＥＴ発現系ベクターは、Ｔ７プロモーターの下流にクローニングした目的遺伝子を非常に強力なＴ７ＲＮＡポリメラーゼによって発現させるベクターである。しかし、決して万能ではなく、うまく発現させることができないタンパク質も報告されている。また、ｐＣｏｌｄ発現系ベクター（非特許文献２、３参照）も広く使われている。このｐＣｏｌｄ発現系ベクターでは、ｃｓｐＡプロモーターを用いて低温下で目的遺伝子を発現させる点でＴ７プロモーター使うｐＥＴ発現系ベクターとは異なる。さらにこのｐＣｏｌｄ発現系ベクターではｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎｅｎｈａｎｃｉｎｇｅｌｅｍｅｎｔ（ＴＥＥ）を用いて翻訳を促進させ、合成量を増加させている。しかし、このＴＥＥは目的遺伝子の開始コドン下流に位置するため、いわゆる”タグ”となり発現対象タンパク質との融合タンパク質として発現する。そのことにより、生来のタンパク質機能を失わせるという悪影響も想定される。
産業上の利用分野	本発明は原核生物用発現ベクターや、かかる原核生物用発現ベクターを含有する原核生物や、かかる原核生物を用いた発現対象のタンパク質の生産方法に関する。
特許請求の範囲	【請求項1】以下の（１）又は（２）記載のポリヌクレオチドと、リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドと、発現対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを順次備えた原核生物用発現ベクター。（１）配列番号１に示すミオシン調節軽鎖（ｍｙｏｓｉｎｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｌｉｇｈｔｃｈａｉｎ：ｍｌｃＲ）をコードするポリヌクレオチドの全長又は部分配列であって、前記配列番号１に示す塩基配列の少なくとも４７４～４８３番目の塩基配列を含むポリヌクレオチド；（２）上記（１）記載のポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド；【請求項2】リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドと、発現対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの間に４～２０塩基のスペーサー配列を備えることを特徴とする請求項１記載の原核生物用発現ベクター。【請求項3】配列番号１に示す塩基配列の少なくとも４７４～４８３番目の塩基配列が、配列番号２に示す塩基配列であることを特徴とする請求項１又は２記載の原核生物用発現ベクター。【請求項4】原核生物が大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）であることを特徴とする請求項１～３のいずれか記載の原核生物用発現ベクター。【請求項5】請求項１～４のいずれか記載の原核生物用発現ベクターを含有する原核生物。【請求項6】請求項５記載の原核生物を培養する工程と、培養した前記原核生物から発現対象のタンパク質を回収する工程を含む、タンパク質の生産方法。【請求項7】タンパク質を発現するためのキットであって、請求項１～４のいずれか記載の原核生物用発現ベクターと、タンパク質を発現するための説明書を含むキット。
国際特許分類(IPC)	C12N 15/70 大腸菌に特に適合するベクターまたは発現システム C12N 1/21 外来遺伝物質の導入によって修飾されたもの C12P 21/02 ２以上のアミノ酸の結合順序が既知のもの，例．グルタチオン
Fターム	4B064AG01 ペプチド、タンパク質 4B064CA02 細菌（ＦＷ） 4B064CA19 外来遺伝子が導入された微生物 4B064DA20 その他（ＦＷ） 4B065AA01 細菌、放線菌 4B065AB01 外来遺伝子が導入されたもの 4B065BA02 ベクターを使用 4B065CA24 ペプチド、蛋白質
出願権利状態	公開

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発明の名称	EXPRESSION VECTORS FOR PROKARYOTES
発明の概要	PROBLEM TO BE SOLVED: To provide expression vectors for prokaryotes designed to include a translation enhancing sequence in an untranslated region of a polynucleotide encoding a protein to be expressed. SOLUTION: Disclosed herein is an expression vector for prokaryotes comprising a polynucleotide described in (1) or (2), (1) a polynucleotide being an entire or partial sequence of a polynucleotide encoding a myosin regulatory light chain (mlcR) which comprises specific 483 bases, where the partial sequence comprises at least a base sequence from the positions 474 to 483, (2) a polynucleotide having at least 90% sequence identity to the polynucleotide (1), a polynucleotide encoding a ribosome-binding site and a polynucleotide encoding a protein to be expressed in this order.

発明の名称

EXPRESSION VECTORS FOR PROKARYOTES

発明の概要

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide expression vectors for prokaryotes designed to include a translation enhancing sequence in an untranslated region of a polynucleotide encoding a protein to be expressed.
SOLUTION: Disclosed herein is an expression vector for prokaryotes comprising a polynucleotide described in (1) or (2), (1) a polynucleotide being an entire or partial sequence of a polynucleotide encoding a myosin regulatory light chain (mlcR) which comprises specific 483 bases, where the partial sequence comprises at least a base sequence from the positions 474 to 483, (2) a polynucleotide having at least 90% sequence identity to the polynucleotide (1), a polynucleotide encoding a ribosome-binding site and a polynucleotide encoding a protein to be expressed in this order.

※ 山口ＴＬＯは平成１１年１１月に山口大学の教官５０名の出資により設立された、リエゾン一体型のＴＬＯ活動会社です。山口大学を主とし、山口県内の大学・高専の研究成果をご紹介致します。特許の内容に興味を持たれた方は、下記までご連絡ください。