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EXPRESSION VECTORS FOR PROKARYOTES

Patent code P200016657
File No. H30-009
Posted date Mar 2, 2020
Application number P2018-137930
Publication number P2020-014392A
Date of filing Jul 23, 2018
Date of publication of application Jan 30, 2020
Inventor
  • (In Japanese)近藤 興
  • (In Japanese)祐村 惠彦
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人山口大学
Title EXPRESSION VECTORS FOR PROKARYOTES
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide expression vectors for prokaryotes designed to include a translation enhancing sequence in an untranslated region of a polynucleotide encoding a protein to be expressed.
SOLUTION: Disclosed herein is an expression vector for prokaryotes comprising a polynucleotide described in (1) or (2), (1) a polynucleotide being an entire or partial sequence of a polynucleotide encoding a myosin regulatory light chain (mlcR) which comprises specific 483 bases, where the partial sequence comprises at least a base sequence from the positions 474 to 483, (2) a polynucleotide having at least 90% sequence identity to the polynucleotide (1), a polynucleotide encoding a ribosome-binding site and a polynucleotide encoding a protein to be expressed in this order.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

近年の遺伝子組換え技術の進展とともに、微生物を用いて様々な有用なタンパク質の生産を行うことが行われるようになった。なかでも細菌は、アミノ酸、タンパク質等の有用物質を生産するために広く利用されている。特に近年は、医薬上・産業上有用なタンパク質の遺伝子を細菌に導入して形質転換し、かかる形質転換体を用いて有用タンパク質を効率的に生産する技術が知られるようになっている。

タンパク質発現に用いる細菌として、グラム陰性菌の一種である大腸菌が汎用されている。大腸菌をタンパク質発現に利用する技術は工業用タンパク質、食品加工用タンパク質及び医薬品用タンパク質の生産にまで幅広く用いられている。

大腸菌を用いたタンパク質生産において様々な発現系ベクターが開発されてきている。最も広く使われる発現系ベクターはpET発現系ベクター(非特許文献1参照)である。pET発現系ベクターは、T7プロモーターの下流にクローニングした目的遺伝子を非常に強力なT7 RNAポリメラーゼによって発現させるベクターである。しかし、決して万能ではなく、うまく発現させることができないタンパク質も報告されている。また、pCold発現系ベクター(非特許文献2、3参照)も広く使われている。このpCold発現系ベクターでは、cspAプロモーターを用いて低温下で目的遺伝子を発現させる点でT7プロモーター使うpET発現系ベクターとは異なる。さらにこのpCold発現系ベクターではtranslation enhancing element(TEE)を用いて翻訳を促進させ、合成量を増加させている。しかし、このTEEは目的遺伝子の開始コドン下流に位置するため、いわゆる”タグ”となり発現対象タンパク質との融合タンパク質として発現する。そのことにより、生来のタンパク質機能を失わせるという悪影響も想定される。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は原核生物用発現ベクターや、かかる原核生物用発現ベクターを含有する原核生物や、かかる原核生物を用いた発現対象のタンパク質の生産方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
以下の(1)又は(2)記載のポリヌクレオチドと、リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドと、発現対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを順次備えた原核生物用発現ベクター。
(1)配列番号1に示すミオシン調節軽鎖(myosin regulatory light chain:mlcR)をコードするポリヌクレオチドの全長又は部分配列であって、前記配列番号1に示す塩基配列の少なくとも474~483番目の塩基配列を含むポリヌクレオチド;
(2)上記(1)記載のポリヌクレオチドと少なくとも90%以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド;

【請求項2】
 
リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドと、発現対象のタンパク質をコードするポリヌクレオチドの間に4~20塩基のスペーサー配列を備えることを特徴とする請求項1記載の原核生物用発現ベクター。

【請求項3】
 
配列番号1に示す塩基配列の少なくとも474~483番目の塩基配列が、配列番号2に示す塩基配列であることを特徴とする請求項1又は2記載の原核生物用発現ベクター。

【請求項4】
 
原核生物が大腸菌(Escherichia coli)であることを特徴とする請求項1~3のいずれか記載の原核生物用発現ベクター。

【請求項5】
 
請求項1~4のいずれか記載の原核生物用発現ベクターを含有する原核生物。

【請求項6】
 
請求項5記載の原核生物を培養する工程と、培養した前記原核生物から発現対象のタンパク質を回収する工程を含む、タンパク質の生産方法。

【請求項7】
 
タンパク質を発現するためのキットであって、請求項1~4のいずれか記載の原核生物用発現ベクターと、タンパク質を発現するための説明書を含むキット。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Published
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