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スクリーニング用ベクター UPDATE

国内特許コード P200016659
整理番号 H30-017
掲載日 2020年3月2日
出願番号 特願2018-187129
公開番号 特開2020-018287
出願日 平成30年10月2日(2018.10.2)
公開日 令和2年2月6日(2020.2.6)
優先権データ
  • 特願2018-137929 (2018.7.23) JP
発明者
  • 近藤 興
  • 祐村 惠彦
出願人
  • 国立大学法人山口大学
発明の名称 スクリーニング用ベクター UPDATE
発明の概要 【課題】IPTG等の発現誘導剤を必要とせず、かつ蛍光を発した株を選択(ポジティブセレクション)することでインサートDNAが導入されたベクターを含有する株をスクリーニング可能なベクターの提供。
【解決手段】特定の塩基配列からなるミオシン調節軽鎖(myosin regulatory light chain:mlcR)をコードするポリヌクレオチドの全長又は部分配列であって、前記塩基配列の少なくとも474~483番目の塩基配列を含むポリヌクレオチドと、リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドと、発色団を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを順次備えたベクター。
【選択図】なし
従来技術、競合技術の概要

遺伝子クローニングは、遺伝子工学実験の基礎技術の一つである。生命科学に関する基礎研究やバイオテクノロジーの応用分野等の様々な場面で日常的に利用されている。制限酵素が発見されて以降、遺伝子クローニングは汎用性の高い手法として浸透し、さらに近年では、DNA配列に依存しないシームレスクローニング(In-Fusion法等)の発達により、自由なDNA配列の改変が可能になっている。その一方で、クローニングが成功したかどうかを判別するスクリーニング方法は、現在でも限定的である。

現在最も広く知られるスクリーニング方法は、「ブルー・ホワイトスクリーニング」である。β-ガラクトシダーゼ(β-galactosidase:β-gal)遺伝子の産物が無色の試薬である5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド(X-galactopyranoside:X-gal)を加水分解し、青い色素を生成する性質に基づく方法である。簡単に説明すると、まず、β-gal遺伝子の内部にインサートDNA配列(目的DNA配列)をライゲーションしたプラスミドベクターを作製する。そのプラスミドベクターを大腸菌(Escherichia coli)に形質転換し(Transformation)、X-galを含む寒天プレートに播種し一晩培養する。その後、形成された青色のコロニーはβ-gal遺伝子がそのままの状態(インサートDNAが入っていない、すなわちハズレ)を示し、白色のコロニーはβ-gal遺伝子が破壊された状態(インサートDNAが入っている、すなわちアタリ)を示すため、青色・白色で目的のコロニーをスクリーニングすることができる。

しかしこの方法には、以下のような問題点がある。まず、形質転換体が白と青の中間色を示す場合があることや、インサートDNAが短い時にインサートDNAを有するコロニーとインサートDNAを有さないコロニーとの区別が難しいこと等により識別が難しく、信頼性がそもそも高いとはいえない。また、色素原基質としてX-galを培地に添加することに加え、β-gal遺伝子の発現を高める為にイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(IPTG)も培地に添加する。これらの試薬は、熱や光に弱く不活化しやすいため、使用する直前に個別の寒天プレートに逐一塗り広げる等する必要があり、作業が非常に煩雑である。さらに、プラスミドベクターの宿主株として、野生型lacZの欠損に加えてLacZのωフラグメントのみをコードしているlacZΔM15遺伝子を持つ変異株を用いなければならないという制限もあった。

上記「ブルー・ホワイトスクリーニング」に代わる技術も開発されている。例えば、プロモーター/オペレーター領域とGFP遺伝子の間にマルチクローニング部位を設けたベクター(非特許文献1参照)が開示されている。かかるベクターを用いれば、コロニーの緑色蛍光によってインサートの挿入の有無を判別することができる。さらに、GFP遺伝子の上流及び下流にマルチクローニング部位を設けたベクター(非特許文献2参照)や、GFPのオープンリーディングフレームの上流にストップコドンを設けたベクター(特許文献1、非特許文献3参照)が開示されている。

また、「ブルー・ホワイトスクリーニング」方法のβ-gal遺伝子の代わりにGFP遺伝子を用いて、目的DNA配列挿入をGFP蛍光の有無によって確認する方法(特許文献2参照)が開示されている。この方法では、インサートDNAが導入された場合には発現するGFPの構造が変化することで緑色蛍光性が損なわれることを利用して、緑色蛍光を発しない株をインサートDNAが導入された株として選択するというものであった。この方法は、ブルー・ホワイトスクリーニングと比較すると偽陽性が少ない。

産業上の利用分野

本発明は形質転換体のスクリーニングに用いることが可能なベクターや、かかるベクターを用いてインサートDNAを含むベクターが導入された形質転換体をスクリーニングする方法や、インサートDNAを含むベクターが導入された形質転換体をスクリーニングするためのキットに関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
以下の(1)又は(2)記載のポリヌクレオチドと、リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドと、発色団を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを順次備えたベクター。
(1)配列番号1に示すミオシン調節軽鎖(myosin regulatory light chain:mlcR)をコードするポリヌクレオチドの全長又は部分配列であって、前記配列番号1に示す塩基配列の少なくとも474~483番目の塩基配列を含むポリヌクレオチド;
(2)上記(1)記載のポリヌクレオチドと少なくとも90%以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド;

【請求項2】
発色団を有するタンパク質が、蛍光タンパク質であることを特徴とする請求項1記載のベクター。

【請求項3】
リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドと、発色団を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの間に4~20塩基のスペーサー配列を備えることを特徴とする請求項1又は2記載のベクター。

【請求項4】
配列番号1に示す塩基配列の少なくとも474~483番目の塩基配列が、配列番号2に示す塩基配列であることを特徴とする請求項1~3のいずれか記載のベクター。

【請求項5】
以下の工程(a)~(c)を備えた、インサートDNAを含むベクターが導入された形質転換体をスクリーニングする方法。
(a)請求項1~4のいずれか記載のベクターにインサートDNAをライゲーションして、インサートDNAを含むベクターを作製する工程;
(b)工程(a)で作製したインサートDNAを含むベクターを宿主細胞に導入する工程;
(c)工程(b)でベクターを導入した宿主細胞における発色の有無により、インサートDNAを含むベクターが導入された形質転換体か否かを判断する工程;

【請求項6】
宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項5記載の方法。

【請求項7】
インサートDNAを含むベクターが導入された形質転換体をスクリーニングするためのキットであって、請求項1~4のいずれか記載のベクターと、請求項5又は6に記載の方法を実施するための説明書を含むキット。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 公開
山口TLOは平成11年11月に山口大学の教官50名の出資により設立された、リエゾン一体型のTLO活動会社です。山口大学を主とし、山口県内の大学・高専の研究成果をご紹介致します。特許の内容に興味を持たれた方は、下記までご連絡ください。


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