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スクリーニング用ベクター

国内特許コード	P200016659
整理番号	Ｈ30-017
掲載日	2020年3月2日
出願番号	特願2018-187129
公開番号	特開2020-018287
出願日	平成30年10月2日(2018.10.2)
公開日	令和2年2月6日(2020.2.6)
優先権データ	特願2018-137929 (2018.7.23) JP
発明者	近藤興祐村惠彦
出願人	国立大学法人山口大学
発明の名称	スクリーニング用ベクター
発明の概要	【課題】ＩＰＴＧ等の発現誘導剤を必要とせず、かつ蛍光を発した株を選択（ポジティブセレクション）することでインサートＤＮＡが導入されたベクターを含有する株をスクリーニング可能なベクターの提供。【解決手段】特定の塩基配列からなるミオシン調節軽鎖（ｍｙｏｓｉｎｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｌｉｇｈｔｃｈａｉｎ：ｍｌｃＲ）をコードするポリヌクレオチドの全長又は部分配列であって、前記塩基配列の少なくとも４７４～４８３番目の塩基配列を含むポリヌクレオチドと、リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドと、発色団を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを順次備えたベクター。【選択図】なし
従来技術、競合技術の概要	遺伝子クローニングは、遺伝子工学実験の基礎技術の一つである。生命科学に関する基礎研究やバイオテクノロジーの応用分野等の様々な場面で日常的に利用されている。制限酵素が発見されて以降、遺伝子クローニングは汎用性の高い手法として浸透し、さらに近年では、ＤＮＡ配列に依存しないシームレスクローニング（Ｉｎ－Ｆｕｓｉｏｎ法等）の発達により、自由なＤＮＡ配列の改変が可能になっている。その一方で、クローニングが成功したかどうかを判別するスクリーニング方法は、現在でも限定的である。現在最も広く知られるスクリーニング方法は、「ブルー・ホワイトスクリーニング」である。β－ガラクトシダーゼ（β－ｇａｌａｃｔｏｓｉｄａｓｅ：β－ｇａｌ）遺伝子の産物が無色の試薬である５－ブロモ－４－クロロ－３－インドリル－β－Ｄ－ガラクトピラノシド（Ｘ－ｇａｌａｃｔｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ：Ｘ－ｇａｌ）を加水分解し、青い色素を生成する性質に基づく方法である。簡単に説明すると、まず、β－ｇａｌ遺伝子の内部にインサートＤＮＡ配列（目的ＤＮＡ配列）をライゲーションしたプラスミドベクターを作製する。そのプラスミドベクターを大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）に形質転換し（Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ）、Ｘ－ｇａｌを含む寒天プレートに播種し一晩培養する。その後、形成された青色のコロニーはβ－ｇａｌ遺伝子がそのままの状態（インサートＤＮＡが入っていない、すなわちハズレ）を示し、白色のコロニーはβ－ｇａｌ遺伝子が破壊された状態（インサートＤＮＡが入っている、すなわちアタリ）を示すため、青色・白色で目的のコロニーをスクリーニングすることができる。しかしこの方法には、以下のような問題点がある。まず、形質転換体が白と青の中間色を示す場合があることや、インサートＤＮＡが短い時にインサートＤＮＡを有するコロニーとインサートＤＮＡを有さないコロニーとの区別が難しいこと等により識別が難しく、信頼性がそもそも高いとはいえない。また、色素原基質としてＸ－ｇａｌを培地に添加することに加え、β－ｇａｌ遺伝子の発現を高める為にイソプロピル－β－チオガラクトピラノシド（ＩＰＴＧ）も培地に添加する。これらの試薬は、熱や光に弱く不活化しやすいため、使用する直前に個別の寒天プレートに逐一塗り広げる等する必要があり、作業が非常に煩雑である。さらに、プラスミドベクターの宿主株として、野生型ｌａｃＺの欠損に加えてＬａｃＺのωフラグメントのみをコードしているｌａｃＺΔＭ１５遺伝子を持つ変異株を用いなければならないという制限もあった。上記「ブルー・ホワイトスクリーニング」に代わる技術も開発されている。例えば、プロモーター／オペレーター領域とＧＦＰ遺伝子の間にマルチクローニング部位を設けたベクター（非特許文献１参照）が開示されている。かかるベクターを用いれば、コロニーの緑色蛍光によってインサートの挿入の有無を判別することができる。さらに、ＧＦＰ遺伝子の上流及び下流にマルチクローニング部位を設けたベクター（非特許文献２参照）や、ＧＦＰのオープンリーディングフレームの上流にストップコドンを設けたベクター（特許文献１、非特許文献３参照）が開示されている。また、「ブルー・ホワイトスクリーニング」方法のβ－ｇａｌ遺伝子の代わりにＧＦＰ遺伝子を用いて、目的ＤＮＡ配列挿入をＧＦＰ蛍光の有無によって確認する方法（特許文献２参照）が開示されている。この方法では、インサートＤＮＡが導入された場合には発現するＧＦＰの構造が変化することで緑色蛍光性が損なわれることを利用して、緑色蛍光を発しない株をインサートＤＮＡが導入された株として選択するというものであった。この方法は、ブルー・ホワイトスクリーニングと比較すると偽陽性が少ない。
産業上の利用分野	本発明は形質転換体のスクリーニングに用いることが可能なベクターや、かかるベクターを用いてインサートＤＮＡを含むベクターが導入された形質転換体をスクリーニングする方法や、インサートＤＮＡを含むベクターが導入された形質転換体をスクリーニングするためのキットに関する。
特許請求の範囲	【請求項1】以下の（１）又は（２）記載のポリヌクレオチドと、リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドと、発色団を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを順次備えたベクター。（１）配列番号１に示すミオシン調節軽鎖（ｍｙｏｓｉｎｒｅｇｕｌａｔｏｒｙｌｉｇｈｔｃｈａｉｎ：ｍｌｃＲ）をコードするポリヌクレオチドの全長又は部分配列であって、前記配列番号１に示す塩基配列の少なくとも４７４～４８３番目の塩基配列を含むポリヌクレオチド；（２）上記（１）記載のポリヌクレオチドと少なくとも９０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド；【請求項2】発色団を有するタンパク質が、蛍光タンパク質であることを特徴とする請求項１記載のベクター。【請求項3】リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドと、発色団を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの間に４～２０塩基のスペーサー配列を備えることを特徴とする請求項１又は２記載のベクター。【請求項4】配列番号１に示す塩基配列の少なくとも４７４～４８３番目の塩基配列が、配列番号２に示す塩基配列であることを特徴とする請求項１～３のいずれか記載のベクター。【請求項5】以下の工程（ａ）～（ｃ）を備えた、インサートＤＮＡを含むベクターが導入された形質転換体をスクリーニングする方法。（ａ）請求項１～４のいずれか記載のベクターにインサートＤＮＡをライゲーションして、インサートＤＮＡを含むベクターを作製する工程；（ｂ）工程（ａ）で作製したインサートＤＮＡを含むベクターを宿主細胞に導入する工程；（ｃ）工程（ｂ）でベクターを導入した宿主細胞における発色の有無により、インサートＤＮＡを含むベクターが導入された形質転換体か否かを判断する工程；【請求項6】宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項５記載の方法。【請求項7】インサートＤＮＡを含むベクターが導入された形質転換体をスクリーニングするためのキットであって、請求項１～４のいずれか記載のベクターと、請求項５又は６に記載の方法を実施するための説明書を含むキット。
国際特許分類(IPC)	C12N 15/63 ベクターを用いた外来遺伝物質の導入；ベクター；そのための宿主の使用；発現の制御 C12Q 1/04 微生物の存在または種類の決定；抗生物質または殺細菌剤の試験のための選択培地の使用；そのための化学指示薬を含む組成物 C12Q 1/6897 C12N 15/12 動物蛋白質をコードする遺伝子 C12N 1/21 外来遺伝物質の導入によって修飾されたもの
Fターム	4B063QA01 定量、存否確認（ＦＷ） 4B063QA18 物質の同定、微生物の同定 4B063QQ06 細菌（←放線菌、マイコプラズマ） 4B063QQ13 遺伝子組換体 4B063QQ42 ＤＮＡ 4B063QQ52 ＲＮＡ 4B063QS05 発現ベクターの作製 4B063QS28 検出に有利、適切な物質への分解、転換 4B063QS38 突然変異、遺伝子組換え、細胞融合処理 4B063QX02 発光、消光（例．蛍光、化学発光） 4B065AA26 エセリシア 4B065AB01 外来遺伝子が導入されたもの 4B065AC14 物質生産能 4B065BA02 ベクターを使用 4B065CA24 ペプチド、蛋白質 4B065CA46 診断、検査
出願権利状態	公開

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発明の名称	SCREENING VECTORS
発明の概要	PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a vector which allows selection of bacterial strains harboring the vector to which an insert DNA has been inserted by selecting fluorescence-emitting strains (positive selection) without using any expression inducer such as IPTG. SOLUTION: Disclosed herein is a vector comprising: a full length polynucleotide encoding myosin regulatory light chain (mlcR) of a specific base sequence or partial sequence thereof comprising at least the base sequence ranging from the 474th base to the 483rd base of the specific base sequence; a polynucleotide encoding a ribosome binding site; and a polynucleotide encoding a protein having a chromophore in this order.

発明の名称

SCREENING VECTORS

発明の概要

PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a vector which allows selection of bacterial strains harboring the vector to which an insert DNA has been inserted by selecting fluorescence-emitting strains (positive selection) without using any expression inducer such as IPTG.
SOLUTION: Disclosed herein is a vector comprising: a full length polynucleotide encoding myosin regulatory light chain (mlcR) of a specific base sequence or partial sequence thereof comprising at least the base sequence ranging from the 474th base to the 483rd base of the specific base sequence; a polynucleotide encoding a ribosome binding site; and a polynucleotide encoding a protein having a chromophore in this order.

※ 山口ＴＬＯは平成１１年１１月に山口大学の教官５０名の出資により設立された、リエゾン一体型のＴＬＯ活動会社です。山口大学を主とし、山口県内の大学・高専の研究成果をご紹介致します。特許の内容に興味を持たれた方は、下記までご連絡ください。