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SCREENING VECTORS UPDATE_EN

Patent code P200016659
File No. H30-017
Posted date Mar 2, 2020
Application number P2018-187129
Publication number P2020-018287A
Date of filing Oct 2, 2018
Date of publication of application Feb 6, 2020
Priority data
  • P2018-137929 (Jul 23, 2018) JP
Inventor
  • (In Japanese)近藤 興
  • (In Japanese)祐村 惠彦
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人山口大学
Title SCREENING VECTORS UPDATE_EN
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a vector which allows selection of bacterial strains harboring the vector to which an insert DNA has been inserted by selecting fluorescence-emitting strains (positive selection) without using any expression inducer such as IPTG.
SOLUTION: Disclosed herein is a vector comprising: a full length polynucleotide encoding myosin regulatory light chain (mlcR) of a specific base sequence or partial sequence thereof comprising at least the base sequence ranging from the 474th base to the 483rd base of the specific base sequence; a polynucleotide encoding a ribosome binding site; and a polynucleotide encoding a protein having a chromophore in this order.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

遺伝子クローニングは、遺伝子工学実験の基礎技術の一つである。生命科学に関する基礎研究やバイオテクノロジーの応用分野等の様々な場面で日常的に利用されている。制限酵素が発見されて以降、遺伝子クローニングは汎用性の高い手法として浸透し、さらに近年では、DNA配列に依存しないシームレスクローニング(In-Fusion法等)の発達により、自由なDNA配列の改変が可能になっている。その一方で、クローニングが成功したかどうかを判別するスクリーニング方法は、現在でも限定的である。

現在最も広く知られるスクリーニング方法は、「ブルー・ホワイトスクリーニング」である。β-ガラクトシダーゼ(β-galactosidase:β-gal)遺伝子の産物が無色の試薬である5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-ガラクトピラノシド(X-galactopyranoside:X-gal)を加水分解し、青い色素を生成する性質に基づく方法である。簡単に説明すると、まず、β-gal遺伝子の内部にインサートDNA配列(目的DNA配列)をライゲーションしたプラスミドベクターを作製する。そのプラスミドベクターを大腸菌(Escherichia coli)に形質転換し(Transformation)、X-galを含む寒天プレートに播種し一晩培養する。その後、形成された青色のコロニーはβ-gal遺伝子がそのままの状態(インサートDNAが入っていない、すなわちハズレ)を示し、白色のコロニーはβ-gal遺伝子が破壊された状態(インサートDNAが入っている、すなわちアタリ)を示すため、青色・白色で目的のコロニーをスクリーニングすることができる。

しかしこの方法には、以下のような問題点がある。まず、形質転換体が白と青の中間色を示す場合があることや、インサートDNAが短い時にインサートDNAを有するコロニーとインサートDNAを有さないコロニーとの区別が難しいこと等により識別が難しく、信頼性がそもそも高いとはいえない。また、色素原基質としてX-galを培地に添加することに加え、β-gal遺伝子の発現を高める為にイソプロピル-β-チオガラクトピラノシド(IPTG)も培地に添加する。これらの試薬は、熱や光に弱く不活化しやすいため、使用する直前に個別の寒天プレートに逐一塗り広げる等する必要があり、作業が非常に煩雑である。さらに、プラスミドベクターの宿主株として、野生型lacZの欠損に加えてLacZのωフラグメントのみをコードしているlacZΔM15遺伝子を持つ変異株を用いなければならないという制限もあった。

上記「ブルー・ホワイトスクリーニング」に代わる技術も開発されている。例えば、プロモーター/オペレーター領域とGFP遺伝子の間にマルチクローニング部位を設けたベクター(非特許文献1参照)が開示されている。かかるベクターを用いれば、コロニーの緑色蛍光によってインサートの挿入の有無を判別することができる。さらに、GFP遺伝子の上流及び下流にマルチクローニング部位を設けたベクター(非特許文献2参照)や、GFPのオープンリーディングフレームの上流にストップコドンを設けたベクター(特許文献1、非特許文献3参照)が開示されている。

また、「ブルー・ホワイトスクリーニング」方法のβ-gal遺伝子の代わりにGFP遺伝子を用いて、目的DNA配列挿入をGFP蛍光の有無によって確認する方法(特許文献2参照)が開示されている。この方法では、インサートDNAが導入された場合には発現するGFPの構造が変化することで緑色蛍光性が損なわれることを利用して、緑色蛍光を発しない株をインサートDNAが導入された株として選択するというものであった。この方法は、ブルー・ホワイトスクリーニングと比較すると偽陽性が少ない。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は形質転換体のスクリーニングに用いることが可能なベクターや、かかるベクターを用いてインサートDNAを含むベクターが導入された形質転換体をスクリーニングする方法や、インサートDNAを含むベクターが導入された形質転換体をスクリーニングするためのキットに関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
以下の(1)又は(2)記載のポリヌクレオチドと、リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドと、発色団を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドとを順次備えたベクター。
(1)配列番号1に示すミオシン調節軽鎖(myosin regulatory light chain:mlcR)をコードするポリヌクレオチドの全長又は部分配列であって、前記配列番号1に示す塩基配列の少なくとも474~483番目の塩基配列を含むポリヌクレオチド;
(2)上記(1)記載のポリヌクレオチドと少なくとも90%以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド;

【請求項2】
 
発色団を有するタンパク質が、蛍光タンパク質であることを特徴とする請求項1記載のベクター。

【請求項3】
 
リボソーム結合サイトをコードするポリヌクレオチドと、発色団を有するタンパク質をコードするポリヌクレオチドの間に4~20塩基のスペーサー配列を備えることを特徴とする請求項1又は2記載のベクター。

【請求項4】
 
配列番号1に示す塩基配列の少なくとも474~483番目の塩基配列が、配列番号2に示す塩基配列であることを特徴とする請求項1~3のいずれか記載のベクター。

【請求項5】
 
以下の工程(a)~(c)を備えた、インサートDNAを含むベクターが導入された形質転換体をスクリーニングする方法。
(a)請求項1~4のいずれか記載のベクターにインサートDNAをライゲーションして、インサートDNAを含むベクターを作製する工程;
(b)工程(a)で作製したインサートDNAを含むベクターを宿主細胞に導入する工程;
(c)工程(b)でベクターを導入した宿主細胞における発色の有無により、インサートDNAを含むベクターが導入された形質転換体か否かを判断する工程;

【請求項6】
 
宿主細胞が大腸菌であることを特徴とする請求項5記載の方法。

【請求項7】
 
インサートDNAを含むベクターが導入された形質転換体をスクリーニングするためのキットであって、請求項1~4のいずれか記載のベクターと、請求項5又は6に記載の方法を実施するための説明書を含むキット。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Published
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