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カテプシンEに強く結合し活性化するペプチド NEW

国内特許コード P200016683
整理番号 S2018-0909-N0
掲載日 2020年3月24日
出願番号 特願2018-153788
公開番号 特開2020-029403
出願日 平成30年8月20日(2018.8.20)
公開日 令和2年2月27日(2020.2.27)
発明者
  • マニッシュ ビヤニ
  • 西垣 功一
  • 高村 禅
  • 黒田 大斗
出願人
  • 国立大学法人北陸先端科学技術大学院大学
発明の名称 カテプシンEに強く結合し活性化するペプチド NEW
発明の概要 【課題】カテプシンE(CE)の生物学的活性を促進するペプチドであって、従来のペプチドよりも高い活性化機能を有するペプチド、及びこのペプチドを用いた試料中のCE活性及びCE量の測定方法の提供。
【解決手段】式1:X1-C-X3-X4-X5-D-X7-X8-V-E-V-Q-X13-E-V-A-E-A-X19-X20-X21-X22-L-X24-L-X26-P-G-X29(式1中、X1はG、L、N、A又はV、X3はP又はT、X4はC、H又はY、X5はI、A、E又はV、X7はF又はL、X8はK又はM、X13はV又はM、X19はL、T、Q又はP、X20はL、S、Q、E又はP、X21はS、T又はA、X22はA又はR、X24はS又はH、X26はS又はH、X29はW又はSである)(配列番号1)のアミノ酸配列を有し、ただしX8がMであり且つX29がSであるアミノ酸配列を除く、ペプチド。
【選択図】図5
従来技術、競合技術の概要

カテプシンE(以下、CEと略記することがある)は細胞内アスパラギン酸プロテアーゼであり、免疫系細胞、消化系上皮細胞および皮膚組織など特定の細胞で主に発現する(非特許文献1)。本酵素は正常皮膚では角化細胞(ケラチノサイト)および毛包の内毛根鞘の領域に存在し、また免疫系細胞のマクロファージなどの抗原提示細胞では主としてエンドソームなどの細胞内小器官に存在する(特許文献1)。

カテプシンE活性の低下により、悪性腫瘍や免疫アレルギー疾患などが生じることが報告されている。川久保らは、カテプシンEはマウス乳腺におけるシグナル伝達、発生、分化および増殖に関連するタンパク質の発現を調節すること、カテプシンEの欠損はマウス乳腺組織において前がん状態を誘発すること (非特許文献2)、さらには血清カテプシンE活性が患者の好ましい予後結果と有意に相関していること(非特許文献3)を報告している。この研究は、カテプシンE発現の抑制が乳房発がんリスクを高め、乳がんの予後不良に結びつくことを示している。加えて、カテプシンE欠損マウスは無菌環境下で飼育しても全く異常を示さないが、通常環境下に移すとアトピー性皮膚炎様症状(AD)を示すことが報告されており、カテプシンEの発現の減少は、ADを有するヒトおよびADマウスモデルNC/Ngaの両方の赤血球においても観察されている(非特許文献4)。一方、臨床的意義は議論の余地があるものの、特定のヒトがんのバイオマーカーとしてのカテプシンEの有用性を示唆する報告がある(非特許文献5~9)。しかし、この相反する報告は、異なるタイプのがん細胞における非機能的カテプシンEの発現レベルの差異から生じていると考えられる(非特許文献3)。

カテプシンEは、強力な抗がん作用を有するプロテアーゼである。マウス実験ではカテプシンEの発現レベルが腫瘍抑制の程度と正に相関することがわかっており、カテプシンEは複数の経路を介して強力な腫瘍増殖と転移を抑制すると考えられている(非特許文献10)。第1にインビトロでカテプシンEががん細胞表面からアポトーシス誘導分子TRAILを特異的に切断遊離し、がん細胞表面のデス受容体に結合することによってがん細胞特異的アポトーシスが誘導されることが明らかになっている(非特許文献10)。さらにはカテプシンEが、腫瘍関連血管新生の抑制に関与していることや、腫瘍周辺部におけるマクロファージの浸潤増加と活性化亢進を誘導することが報告されている(非特許文献10)。また、カテプシンEは、ヒト前立腺がん細胞の増殖停止とアポトーシスを誘導することも報告されている(非特許文献11)。最近の研究では、カテプシンE発現の血清レベルと臨床病理学的パラメータとの間の相関分析により、タンパク質レベルではなく活性レベルが乳がんステージおよび進行と負に関連しているとの報告がある(非特許文献3)。

したがって、カテプシンEの発現/活性を増加させる薬剤が、がん治療に役立つことが期待されている。特に、ペプチド創薬の標的としてカテプシンEは非常に興味深い。創薬で現在主流となっている抗体医薬の問題点として、抗体の分子量が大きいことや合成コストが高いことなどが挙げられる。一方、ペプチドは、抗体の100分の1ほどのサイズであり低コストで合成できること、分子改変や化学修飾が容易であるためドラッグデリバリーシステムへの応用や分子ミミック化によって標的分子の生理活性の調節が可能であるといったメリットがある。

カテプシンEに特異的に結合し、その活性について阻害作用を有するペプチドが報告されている(特許文献2)。このペプチドはin-vitro-virus(IVV)法を使用した、分子淘汰操作により作成された。
一方、酵素に特異的に結合するペプチド(ペプチドアプタマー)の開発において、酵素活性阻害作用を有するものに比較し、酵素活性化作用を有するペプチドの開発は困難である。カテプシンE活性化ペプチドは、高速化された試験管内分子進化法である発達ライブラリー法を用いてライブラリーを進化させ、SFリンク法(非特許文献12)を使用して酵素活性機能について淘汰することにより開発されている(非特許文献13および14)。ビヤニらは、一次ライブラリーおよび二次ライブラリーとして、中性環境下でカテプシンEを活性化する8から16アミノ酸残基長のペプチドの開発を報告した(非特許文献13)。小松らは、8アミノ酸残基長の2つのペプチドをリンカーで連結した三次ライブラリーの作成を報告している(非特許文献14)。

さらには、カテプシンEについて腫瘍マーカーとしての利用が提案されている。被検試料中のカテプシンEの量を測定し、測定結果と乳がんの可能性または乳がんの予後とを関連付けることにより乳がんを検出する方法が報告されている(特許文献3)。カテプシンEの測定が、カテプシンEの基質、カテプシンEに対する抗体、またはカテプシンEに対して特異的に親和性を有するペプチド性化合物(アプタマー)を用いて行われてもよいと報告されている(特許文献3)。カテプシンEに特異的に結合するペプチドを用いてカテプシンEの量を測定する方法が報告されている(特許文献4及び非特許文献15)。さらには、カテプシンEタンパク質あるいはカテプシンEタンパク質の発現促進作用(インターフェロンγまたはリポ多糖)を有する物質を含む、老化現象を改善、防止または遅延させるための医薬組成物が報告されている(特許文献1)。

産業上の利用分野

本発明は、新規ペプチドとその使用に関する。より具体的には、酵素活性に影響を与えるペプチド、該ペプチドを含む医薬、および該ペプチドを利用した酵素の検出方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
式1:X1-C-X3-X4-X5-D-X7-X8-V-E-V-Q-X13-E-V-A-E-A-X19-X20-X21-X22-L-X24-L-X26-P-G-X29
(式1中、X1はG、L、N、AまたはVであり、
X3はPまたはTであり、
X4はC、HまたはYであり、
X5はI、A、EまたはVであり、
X7はFまたはLであり、
X8はKまたはMであり、
X13はVまたはMであり、
X19はL、T、QまたはPであり、
X20はL、S、Q、EまたはPであり、
X21はS、TまたはAであり、
X22はAまたはRであり、
X24はSまたはHであり、
X26はSまたはHであり、
X29はWまたはSである)(配列番号1)のアミノ酸配列を有し、但しX8がMであり且つX29がSであるアミノ酸配列を除く、ペプチド。

【請求項2】
前記式1のX8がKである(配列番号2)、請求項1に記載のペプチド。

【請求項3】
前記式1のX8がMであり、X29がWである(配列番号3)、請求項1に記載のペプチド。

【請求項4】
前記式1中、
X1はGまたはLであり、
X3はPであり、
X4はCまたはHであり、
X5はIまたはAであり、
X7はFであり、
X19はLであり、
X20はL、S、QまたはEであり、
X21はSまたはTであり、
X22はAである(配列番号4~6)、
請求項1~3のいずれか一項に記載のペプチド。

【請求項5】
カテプシンEの元の酵素活性を100%とすると、三次ライブラリーで得られたペプチド(CEAP3)よりも、カテプシンEの酵素活性をさらに約20%以上、上昇させる、請求項1~4のいずれか一項に記載のペプチド。

【請求項6】
カテプシンEへの結合に対する解離定数(KD)は1nM以下である、請求項1~5のいずれか一項に記載のペプチド。

【請求項7】
請求項1~6のいずれか一項に記載のペプチドを含む、がんを治療するための医薬。

【請求項8】
試料中のカテプシンEの酵素活性測定方法であって、
(a)固相化されたペプチドアプタマーと試料を混合し、固相化ペプチドアプタマーに結合したカテプシンEを得る工程、
(b)固相化ペプチドアプタマーに結合したカテプシンEと、標識されたカテプシンE基質を接触させる工程、および
(C)カテプシンEによるカテプシンE基質の切断を検出してカテプシンE酵素活性を求める工程
を含み、前記ペプチドアプタマーが請求項1~6のいずれか一項に記載のペプチドである、方法。

【請求項9】
試料中に含まれるカテプシンE量の測定方法であって、
(a)固相化されたペプチドアプタマーと試料を混合し、固相化ペプチドアプタマーに結合したカテプシンEを得る工程、および
(b)カテプシンEが結合したペプチドアプタマーを検出し、試料中のカテプシンE量を求める工程
を含み、前記ペプチドアプタマーが請求項1~6のいずれか一項に記載のペプチドである、方法。

【請求項10】
カーボンナノチューブ電界効果型トランジスタ法を用いて実施される請求項9に記載の方法であって、
前記工程(a)において、固相化されたペプチドアプタマーは、電極に設置されたカーボンナノチューブに固相化されたペプチドアプタマーであり、そして
前記工程(b)は、前記ペプチドアプタマーとカテプシンEの結合前後において、前記電極に生じる標準電極に対する電位差を測定することを含む工程である、方法。
国際特許分類(IPC)
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出願権利状態 公開
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