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蛍光共鳴エネルギー移動の原理に基づく一分子型FRETバイオセンサーのリンカー 外国出願あり

国内特許コード P200016724
整理番号 2879
掲載日 2020年4月2日
出願番号 特願2012-536438
登録番号 特許第5802674号
出願日 平成23年9月26日(2011.9.26)
登録日 平成27年9月4日(2015.9.4)
国際出願番号 JP2011071891
国際公開番号 WO2012043477
国際出願日 平成23年9月26日(2011.9.26)
国際公開日 平成24年4月5日(2012.4.5)
優先権データ
  • 特願2010-215738 (2010.9.27) JP
発明者
  • 松田 道行
  • 小松 直貴
  • 青木 一洋
  • 上岡 裕治
  • 幸長 弘子
  • 稲岡 芳恵
  • 櫻井 敦朗
  • 清川 悦子
  • 隅山 健太
出願人
  • 国立大学法人京都大学
発明の名称 蛍光共鳴エネルギー移動の原理に基づく一分子型FRETバイオセンサーのリンカー 外国出願あり
発明の概要 【課題】本発明は、非侵襲的なセリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、低分子量GTP結合タンパク質の活性などの測定を可能にする、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に基づく一分子型FRETバイオセンサーのリンカー及び概リンカーを含む一分子型FRETバイオセンサーなどを提供することを課題とする。
【解決手段】52アミノ酸残基以上400アミノ酸残基以下を含むポリペプチドであって、全アミノ酸残基数の少なくとも95%がグリシン、セリン、スレオニン及びアラニンからなり、グリシンを35から65%、セリン及びスレオニンの少なくともいずれかを10から40%、アラニンを10から40%含むリンカー、及び概リンカーを含む一分子型FRETバイオセンサー、該バイオセンサーをコードする遺伝子を含む発現ベクターを保持する形質転換された細胞およびトランスジェニック非ヒト動物である。
従来技術、競合技術の概要

蛍光共鳴エネルギー移動(Fluorescence resonance energy transfer、以下FRETと称することがある)の原理と蛍光蛋白とを利用したバイオセンサーが生命科学の分野において急速に広がっている(例えば非特許文献1-4参照)。

FRETとは、励起状態にある蛍光分子(ドナー:エネルギー供与体)からごく近傍の蛍光分子(アクセプター:エネルギー受容体)へ励起エネルギーが移動する現象のことである。FRETを利用したバイオセンサーの普及には、緑色蛍光蛋白(GFP)の色変異体の出現やそれらの改良が大きく寄与している。現在、多くの場合、GFP変異体であるCFP(シアン蛍光蛋白)とYFP(黄色蛍光蛋白)とがドナーおよびアクセプター蛍光タンパク質として利用されている。

蛍光タンパク質を用いたFRETバイオセンサーの系は、二分子型FRETバイオセンサー(図1)と一分子型FRETバイオセンサー(図2)に大別される。二分子型FRETバイオセンサーは分子間相互作用を検出するものであり、一分子型FRETバイオセンサーは分子の構造変化を検出するものである(例えば非特許文献1-4参照)。

このうち、1分子型のバイオセンサー(一分子型FRETバイオセンサー)は、イオン、糖、脂質などの低分子の定量や、低分子量GTP結合タンパク、リン酸化酵素などの活性測定に用いられるものが開発されている(例えば非特許文献4参照)。
しかし、このバイオセンサー作成のためには、少なくとも3つ、多くの場合4つ以上のタンパク質ドメインを結合する必要があり、それらを単に結合しただけでは通常、十分な感度を有する一分子型FRETバイオセンサーを作成することはできない。すなわち、このような一分子型FRETバイオセンサーを作成するためには、i)ドナー蛍光タンパク質の発光スペクトラムとアクセプター蛍光タンパク質の吸光スペクトラムとの重なり、ii)ドナー蛍光タンパク質とアクセプター蛍光タンパク質間の距離、iii)ドナー蛍光タンパク質の発光モーメントとアクセプター蛍光タンパク質の吸光モーメントの配向の3因子を考慮しなければならない。また、蛍光タンパク質を他のタンパク質と融合する場合、他のタンパク質と融合することがストレスとなって蛍光タンパク質のミスフォールディングが生じ、その結果、発色団形成の効率が低下し、無蛍光となる可能性をも考慮しなければならない。このように、ドナー蛍光タンパク質とアクセプター蛍光タンパク質を利用して両者間にFRETの良好な発現を生じさせるには厳格な条件が存在し、両者間の配置等に一定の規則も見出されていないため、作成する一分子型FRETバイオセンサーごとに、それぞれのタンパク質ドメインの長さや、ドメイン間のリンカー配列などをさまざまに変更させて、至適なものを作成することが行われているが、これには、多くの試行錯誤や複雑高度の実験等を要し、十分な感度を有する一分子型FRETバイオセンサーの開発は非常な困難を伴うものであった。

各ドメインをつなぐリンカーとしては、9アミノ酸のグリシン、セリン、スレオニンからなるものや(例えば非特許文献5参照)、72アミノ酸のグリシンリンカー(例えば非特許文献6参照)が報告されているが、十分に最適化しているとはいえなかった。また、これらのリンカーにおいては、多くの種類の一分子型FRETバイオセンサーに共通して最適化を図れるものではなかった。

産業上の利用分野

本発明は、蛍光共鳴エネルギー移動の原理に基づく一分子型FRETバイオセンサーを最適化するためのリンカー、該リンカーを含むバイオセンサー、該リンカー又は一分子型FRETバイオセンサーをコードする遺伝子、該リンカー又は一分子型FRETバイオセンサーを含む発現ベクター、該発現ベクターを有する形質転換された細胞およびトランスジェニック非ヒト動物、前記バイオセンサーを用いる測定方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
蛍光共鳴エネルギー移動の原理に基づく一分子型FRETバイオセンサーのリンカーであって、52アミノ酸残基以上400アミノ酸残基以下を含むポリペプチドであって、全アミノ酸残基数の少なくとも45%がグリシン及びアラニンの少なくともいずれかであり、下記(i)及び(ii)のいずれかを満たすことを特徴とするリンカー
(i)全アミノ酸残基数の少なくとも95%がグリシン、セリン、スレオニン及びアラニンであり、全アミノ酸残基数の35%から65%がグリシンであり、全アミノ酸残基数の10%から40%がセリン及びスレオニンの少なくともいずれかであり、全アミノ酸残基数の10%から40%がアラニンであり、全アミノ酸配列の少なくとも88%がSAGG及びGGASのいずれかのアミノ酸配列の繰り返しからなるリンカー、
(ii)全アミノ酸残基数の少なくとも10%がアルギニン及びグルタミン酸の少なくともいずれかであり、全アミノ酸残基数の少なくとも95%がグリシン、アルギニン、グルタミン酸及びアラニンであり、全アミノ酸残基数の4%から30%がグリシンであり、全アミノ酸残基数の5%から30%がアルギニンであり、全アミノ酸残基数の5%から30%がグルタミン酸であり、全アミノ酸残基数の30%から60%がアラニンであり、全アミノ酸配列の少なくとも89%がEAAARのアミノ酸配列の繰り返しからなるリンカー

【請求項2】
84アミノ酸残基以上を含むポリペプチドである請求項1に記載のリンカー。

【請求項3】
下記(i)を満たす請求項1に記載のリンカー、
(i)全アミノ酸残基数の少なくとも95%がグリシン、セリン、スレオニン及びアラニンであり、全アミノ酸残基数の35%から65%がグリシンであり、全アミノ酸残基数の10%から40%がセリン及びスレオニンの少なくともいずれかであり、全アミノ酸残基数の10%から40%がアラニンであり、全アミノ酸配列の少なくとも88%がSAGG及びGGASのいずれかのアミノ酸配列の繰り返しからなるリンカー。

【請求項4】
SAGG及びGGASのいずれかのアミノ酸配列の繰り返し単位を13個以上100個以下含む請求項3に記載のリンカー。

【請求項5】
SAGG及びGGASのいずれかのアミノ酸配列の繰り返し単位を12個以上54個以下含む請求項3に記載のリンカー。

【請求項6】
配列番号:12、配列番号:15、配列番号:18、配列番号:23、及び配列番号:26のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる請求項3から5のいずれかに記載のリンカー。

【請求項7】
下記(ii)を満たす請求項1に記載のリンカー、
(ii)全アミノ酸残基数の少なくとも10%がアルギニン及びグルタミン酸の少なくともいずれかであり、全アミノ酸残基数の少なくとも95%がグリシン、アルギニン、グルタミン酸及びアラニンであり、全アミノ酸残基数の4%から30%がグリシンであり、全アミノ酸残基数の5%から30%がアルギニンであり、全アミノ酸残基数の5%から30%がグルタミン酸であり、全アミノ酸残基数の30%から60%がアラニンであり、全アミノ酸配列の少なくとも89%がEAAARのアミノ酸配列の繰り返しからなるリンカー。

【請求項8】
配列番号:45及び配列番号:46のいずれかで表されるアミノ酸配列からなる請求項7に記載のリンカー。

【請求項9】
請求項1から8のいずれかに記載のリンカーをコードすることを特徴とする遺伝子。

【請求項10】
請求項1から8のいずれかに記載のリンカーをコードする遺伝子を含むことを特徴とする発現ベクター。

【請求項11】
請求項10に記載の発現ベクターを保持してなることを特徴とする形質転換された細胞。

【請求項12】
請求項10に記載の発現ベクターを保持してなることを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物。

【請求項13】
蛍光共鳴エネルギー移動の原理に基づく一分子型FRETバイオセンサーであって、センサー領域、リガンド領域、アクセプター蛍光タンパク質領域、ドナー蛍光タンパク質領域、及び、該センサー領域と該リガンド領域とを連結するリンカー領域を有する融合タンパク質であり、該リンカー領域が、請求項1から8のいずれかに記載のリンカーからなることを特徴とする一分子型FRETバイオセンサー。

【請求項14】
該ドナー蛍光タンパク質がYPetである請求項13に記載の一分子型FRETバイオセンサー。

【請求項15】
請求項13及び14のいずれかに記載の一分子型FRETバイオセンサーをコードすることを特徴とする遺伝子。

【請求項16】
請求項15に記載の一分子型FRETバイオセンサーをコードする遺伝子を含むことを特徴とする発現ベクター。

【請求項17】
請求項16に記載の発現ベクターを保持してなることを特徴とする形質転換された細胞。

【請求項18】
請求項16に記載の発現ベクターを保持してなることを特徴とするトランスジェニック非ヒト動物。

【請求項19】
請求項13に記載の一分子型FRETバイオセンサーを用いてFRETを検出する工程を含み、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量GTP結合タンパク質活性のいずれかを測定することを特徴とする測定方法。

【請求項20】
請求項17に記載の形質転換された細胞または請求項18に記載のトランスジェニック非ヒト動物を用いてFRETを検出する工程を含み、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量GTP結合タンパク質活性のいずれかを測定することを特徴とする測定方法。

【請求項21】
(a)請求項17に記載の形質転換された細胞と被検物質とを接触させる工程、及び
(b)FRETを検出することによりセリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量GTP結合タンパク質活性のいずれかの変化を検出する工程、
を含む、セリンスレオニンリン酸化酵素活性、チロシンリン酸化酵素活性、及び、低分子量GTP結合タンパク質活性のいずれかの調節物質のスクリーニング方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
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出願権利状態 登録
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