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METHOD FOR DETECTING QUADRUPLE HELICAL STRUCTURE OF NUCLEIC ACID CHAIN

Patent code P200016792
File No. 2013-5
Posted date Apr 24, 2020
Application number P2013-199029
Publication number P2015-062388A
Patent number P6300263
Date of filing Sep 25, 2013
Date of publication of application Apr 9, 2015
Date of registration Mar 9, 2018
Inventor
  • (In Japanese)三好 大輔
  • (In Japanese)前田 龍一
Applicant
  • (In Japanese)学校法人甲南学園
Title METHOD FOR DETECTING QUADRUPLE HELICAL STRUCTURE OF NUCLEIC ACID CHAIN
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a technique to sequence-specifically detect a quadruple helical structure of a nucleic acid chain.
SOLUTION: A quadruple helical structure of a nucleic acid chain can be detected sequence-specifically by using a fluorescent substance with a relation between a donor fluorescent substance and an acceptor fluorescent substance in a fluorescence energy transfer as a fluorescent substance labeled with: a (i) ligand which can specifically bind to the quadruple helical structure of the nucleic acid chain and consists of a fluorescent substance which exhibits a fluorescence when binding to the quadruple helical structure concerned; and (ii) a nucleic acid probe labeled with a fluorescent substance, being present in the nucleic acid chain having the quadruple helical structure to be targeted, and has a complementary strand which can hybridize to the base sequence located in the region where a fluorescence energy transfer from the quadruple helical structure concerned is enabled.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

RNAやDNA等の核酸鎖において、グアニジンに富む配列部分がグアニン四量体(G-quartet)を形成して四重螺旋構造を形成することが知られている。核酸鎖の四重螺旋構造は、様々な遺伝子の発現や酵素機能を制御することで、細胞の加齢、ガン化等に関与していることが知られている。

また、四重螺旋構造を形成できる塩基配列は、DNAでは30万種類以上、RNAでは3千種類以上存在すると考えられており(非特許文献1参照)、特に、ガン関連遺伝子(例えば、C-MYC、NRAS、BCL2等)、細胞分化関連遺伝子(例えば、HCK等)、血管新生関連遺伝子(例えば、VEGF等)、翻訳因子(例えば、FOS等)のmRNAには、四重螺旋構造を形成できる配列が局在化していることも知られている。そのため、医薬品やバイオプローブの開発の観点から、配列特異的に核酸鎖の四重螺旋構造を検出する技術が求められている。

これまでに、ベルベリン、チオフラビンT、銅フタロシアニンテトラスルホン酸、N―メチルメソポルフィリン(NMM)等の低分子化合物は、核酸鎖の四重螺旋構造に対して親和性と特異性を持ち、核酸鎖の四重螺旋構造と結合すると蛍光を発する性質があることが解明されており、従来、核酸鎖の四重螺旋構造の検出には、これらの低分子化合物(リガンド)が使用されている(非特許文献2参照)。

しかしながら、このような低分子化合物では、極めて多様な配列が形成する類似の4重螺旋構造を配列特異的に識別することができない。とりわけ、RNAが形成する四重螺旋構造は、配列に依らず立体構造の類似性が極めて高いことが知られており(非特許文献3参照)、従来技術で、RNAの四重螺旋構造を配列特異的に識別することは不可能といえる。

そこで、核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に検出する技術を開発できれば、疾患の診断、治療薬の開発、生理機能の究明等に福音をもたらすことが期待される。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、核酸鎖の四重螺旋構造の検出方法、より詳細には配列特異的に核酸鎖の四重螺旋構造を検出する方法に関する。更に、本発明は、当該核酸鎖の四重螺旋構造の検出方法を行うための検出キットに関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
下記第1工程及び第2工程を含むことを特徴とする、核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に検出する方法:
第1工程:被検核酸試料に対して(i)リガンドと(ii)核酸プローブを接触させる工程;
ここで、前記(i)リガンドが、チオフラビンT、銅フタロシアニンテトラスルホン酸及びその塩、並びにN―メチルメソポルフィリンよりなる群から選択される少なくとも1種であり、
前記(ii)核酸プローブが、蛍光物質で標識されてなる核酸プローブであって、標的となる四重螺旋構造を有する核酸鎖に存在し、且つ当該四重螺旋構造から蛍光エネルギー移動が可能な領域に位置している塩基配列に対してハイブリダイズできる塩基配列を有するプローブであり、
前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質が、蛍光エネルギー移動におけるドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質の関係にある。
第2工程:前記ドナー蛍光物質を励起させて蛍光エネルギー移動を測定する工程。

【請求項2】
 
前記被検核酸試料がRNAを含む試料であり、RNAの四重螺旋構造を配列特異的に検出する、請求項1に記載の検出方法。

【請求項3】
 
前記核酸鎖において、前記(ii)核酸プローブがハイブリダイズする領域の塩基配列の3’末端が、核酸鎖において標的となる四重螺旋構造を形成している塩基配列の5’末端の塩基をn位とした場合にn-1位~n-25位である、請求項1又は2に記載の検出方法。

【請求項4】
 
前記核酸鎖において、前記(ii)核酸プローブがハイブリダイズする領域の塩基配列の5’末端が、核酸鎖において標的となる四重螺旋構造を形成している塩基配列の3’末端の塩基をn位とした場合にn+1位~n+25位である、請求項1又は2に記載の検出方法。

【請求項5】
 
前記(ii)核酸プローブに含まれる塩基数が5~20個である、請求項1~4のいずれかに記載の検出方法。

【請求項6】
 
前記(i)リガンドがチオフラビンTであり、(ii)核酸プローブを標識している蛍光物質がROXである、請求項1~5のいずれかに記載の検出方法。

【請求項7】
 
核酸鎖の四重螺旋構造を配列特異的に検出するための検出キットであって、
(i)チオフラビンT、銅フタロシアニンテトラスルホン酸及びその塩、並びにN―メチルメソポルフィリンよりなる群から選択される少なくとも1種からなるリガンドと、
(ii)蛍光物質で標識されてなる核酸プローブであって、標的となる四重螺旋構造を有する核酸鎖に存在し、且つ当該四重螺旋構造から蛍光エネルギー移動が可能な領域に位置している塩基配列に対してハイブリダイズできる相補鎖を有する核酸プローブと、を含み、
前記(i)リガンドと前記(ii)核酸プローブに標識された蛍光物質が、蛍光エネルギー移動におけるドナー蛍光物質とアクセプター蛍光物質の関係にある、ことを特徴とする、検出キット。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Registered
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