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SCREENING METHOD OF RNA APTAMER

Patent code P200016797
File No. 2017-1
Posted date Apr 24, 2020
Application number P2018-032974
Publication number P2019-146516A
Date of filing Feb 27, 2018
Date of publication of application Sep 5, 2019
Inventor
  • (In Japanese)杉本 直己
  • (In Japanese)遠藤 玉樹
Applicant
  • (In Japanese)学校法人甲南学園
Title SCREENING METHOD OF RNA APTAMER
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide techniques for further improving screening efficiency of RNA aptamers.
SOLUTION: Provided is a screening method of RNA aptamer comprising (A) preparing an immobilized template double-stranded DNA library (LA) which is composed of a single-stranded DNA containing a promoter sequence complementary sequence, a capture sequence, and a template sequence of a candidate RNA aptamer, and a complementary strand DNA thereof, as well as in which a number of tagged template double-stranded DNA clones in which capture tags (Pt) are added to the complementary strand DNA are immobilized on the microsurface of the solid carrier; (B) performing a transcription reaction and preparing an immobilized RNA/DNA complex library (LB) in which an RNA aptamer candidate is bound to the capture tag (Pt); and (C) contacting the immobilized RNA/DNA complex library (LB) with a target substance and selecting RNA aptamer candidates bound to the target substance.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

核酸アプタマーは、標的を特異的に認識できる一本鎖のDNA又はRNAであり、医薬品の開発及び診断技術への応用研究が盛んに行われている。特に、RNAはDNAよりも複雑な構造を形成可能である点等で、核酸アプタマーとしてより優れている。

核酸アプタマーを取得する手法としては、SELEX(Systematic Evolution of Ligands By EXponential enrichment)法が挙げられる。SELEX法では、標的分子を担体に固定化し、アプタマー候補配列のバリエーションを有するDNA又はRNAの集団(ライブラリ)と接触させる。そして、担体を遠心分離等で回収することで、担体に固定化させておいた標的分子と相互作用したDNA又はRNAを取得する。SELEX法では、回収した核酸を、RNAの場合はRT-PCR、DNAの場合はPCRによって増幅し、再度DNAライブラリ又はRNAライブラリとして調製し、再び同様の選別操作に供する。このような同様の選別操作を繰り返すことによって、標的分子と特異的に相互作用したDNA又はRNA(DNAアプタマー又はRNAアプタマー)を濃縮する。

SELEX法に供される最初のライブラリにおいては、一般的に30塩基以上のランダムな配列領域を含む配列がアプタマー候補配列として使用される。30塩基のランダム配列のバリエーションは430通りつまり1018通り以上であり、すべての配列を1分子ずつ含むアプタマー候補配列の総量は重さに換算して約18mgとなる。さらにPCRでプライマーを結合させるために必要な40塩基程度の固定された配列をアプタマー候補配列に足すと、総量は約40mgとなる。したがって、最初の選別操作の段階で全てのバリエーションを最初のライブラリに含ませることは実験のスケールを考慮すると現実的ではないため、通常は、膨大な組み合わせの中からごく一部の組み合わせのみを最初のライブラリとして使用し、そこから上述の選別操作を繰り返し、標的分子と特異的に相互作用を示す核酸を濃縮する。濃縮されたアプタマー候補配列に対しては、標的分子との相互作用を示す配列をさらに最適化するため、濃縮された塩基配列間で共通性の高い配列を固定する一方で周囲の配列に変異を加えたライブラリを別途構築し、上述のように選別操作を繰り返すという作業が行われる。

従来のSELEX法では、標的分子を担体上に化学的に固定化する必要があったが、近年では、様々な改変手法が報告されている。例えば、特許文献1では、標的分子を固定せず、核酸と標的分子との複合体形成に伴う分子サイズの変化を利用して選別を行う手法が報告されている。また、非特許文献1では、ライブラリとなる核酸の側を担体に固定化し、核酸と標的分子との結合に伴う蛍光シグナル変化等を利用して選別を行う手法が報告されている。核酸の側を担体に固定化する手段としてはエマルジョンPCRを用いており、1個の担体粒子に十万コピー以上の多数のクローンDNAを固定化することが可能であることから、標的分子との結合に伴う蛍光シグナル変化が増大することで、選別の効率が向上している。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明はRNAアプタマーのスクリーニング方法、キット、及びライブラリに関する。より具体的には、RNAアプタマー候補のクローンを固相担体の微小表面に集合して固定することによって、RNAアプタマーのスクリーニング効率を大幅に向上させる技術に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
下記(A)工程から(C)工程を含む、RNAアプタマーのスクリーニング方法:
(A)RNAアプタマー候補の鋳型配列を含むタグ付鋳型二本鎖DNAのクローンを、前記RNAアプタマー候補の鋳型配列に応じて複数種含む固定化鋳型二重鎖DNAライブラリであって;前記タグ付鋳型二本鎖DNAが、一方端から他方端へ向かって、RNAポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列の相補配列、捕捉用配列、及び前記RNAアプタマー候補の鋳型配列を含む一本鎖DNAと、その相補鎖DNAとで構成される二本鎖DNAと、前記相補鎖DNAの前記一方端に結合した、リンカー及び前記捕捉用配列を含む捕捉用タグ(Pt)とを含み、前記他方端で固相担体に固定されており;且つ、前記タグ付鋳型二本鎖DNAのクローンごとに前記固相担体の特定の微小表面に固定化されている、固定化鋳型二重鎖DNAライブラリ(LA)を準備する工程と、
(B)前記鋳型二重鎖DNAライブラリ(LA)を転写反応に供し、前記捕捉用配列の相補配列が付加された前記RNAアプタマー候補を合成するとともに前記RNAアプタマー候補を前記捕捉用タグ(Pt)に捕捉させることによって、固定化RNA/DNA複合体ライブラリ(LB)を調製する工程と、
(C)前記固定化RNA/DNA複合体ライブラリ(LB)を標的物質と接触させ、前記標的物質と結合した前記RNAアプタマー候補を有するRNA/DNA複合体のクローンが固定化された前記微小表面を選別する工程。

【請求項2】
 
前記(A)工程が、以下の工程を含む、請求項1に記載の方法:
(A1)前記一本鎖DNAのクローンを、前記RNAアプタマー候補の鋳型配列に応じて複数種含むDNAライブラリであって、前記一本鎖DNAのクローンごとに前記固相担体の特定の微小表面に固定化されている固定化一本鎖DNAライブラリ(L0)を準備する工程、及び
(A2)前記固定化一本鎖DNAライブラリ(L0)を、前記捕捉用配列及びリンカーを有する捕捉用タグ(Pt)と前記プロモータ配列とを含むプライマー(P)を用いたプライマー伸長反応に供し、前記固定化鋳型二重鎖DNAライブラリ(LA)を得る工程。

【請求項3】
 
前記(A1)工程において、前記一本鎖DNA、その相補鎖DNA、又は、前記一本鎖DNAと前記相補鎖DNAとで構成される二本鎖DNAを、前記固相担体の存在下で、プライマーを用いた単分子PCRに供することによって、前記固定化一本鎖DNAライブラリ(L0)を得る、請求項2に記載の方法。

【請求項4】
 
前記(A)工程が、以下の工程を含む、請求項1に記載の方法:
(A11)前記一本鎖DNA、その相補鎖DNA、又は、前記一本鎖DNAと前記相補鎖DNAとで構成される二本鎖DNAを、前記固相担体の存在下で、前記捕捉用配列及びリンカーを有する捕捉用タグ(Pt)と前記プロモータ配列とを含むプライマー(P)を用いた単分子PCRに供し、前記固定化鋳型二重鎖DNAライブラリ(LA)を得る工程。

【請求項5】
 
前記固相担体が微粒子担体であり、前記微小表面が前記微粒子担体の表面であり、且つ、前記(C)工程において、前記標的物質と結合した前記RNAアプタマー候補を有するRNA/DNA複合体のクローンが固定化された微粒子担体の分取を行う、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。

【請求項6】
 
前記(C)工程における分取をセルソータによって行う、請求項5に記載の方法。

【請求項7】
 
前記固相担体が基板担体であり、前記微小表面が前記基板担体の表面上の特定の微小領域であり、且つ、前記(C)工程において、前記標的物質と結合した前記RNAアプタマー候補を有するRNA/DNA複合体のクローンが固定化された微小領域の特定を行う、請求項1~4のいずれか1項に記載の方法。

【請求項8】
 
前記(B)工程の転写反応における一の条件及び前記(C)工程の標的物質との接触における一の条件あたり、前記(A)工程から前記(C)工程を1回のみ行う、請求項1~7のいずれか1項に記載の方法。

【請求項9】
 
前記プロモータ配列がT7プロモータ配列である、請求項1~8のいずれか1項に記載の方法。

【請求項10】
 
前記リンカーがポリアルキレングリコール鎖である、請求項1~9のいずれか1項に記載の方法。

【請求項11】
 
RNAポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列の相補配列と、捕捉用配列とを含む前記一本鎖DNA、その相補鎖DNA、又は、前記一本鎖DNAと前記相補鎖DNAとで構成される二本鎖DNAと、
前記捕捉用配列及びリンカーを有する捕捉用タグ(Pt)と、前記プロモータ配列を含むプライマー(P)と、
を含む、RNAアプタマーのスクリーニングキット。

【請求項12】
 
RNAアプタマー候補の鋳型配列を含むタグ付鋳型二本鎖DNAのクローンを、前記RNAアプタマー候補の鋳型配列に応じて複数種含むライブラリであって、
前記タグ付鋳型二本鎖DNAが、一方端から他方端へ向かって、RNAポリメラーゼ活性を有する酵素のプロモータ配列の相補配列、捕捉用配列、及びRNAアプタマー候補の鋳型配列を含む一本鎖DNAと、その相補鎖DNAとで構成される二本鎖DNAと、前記相補鎖の前記一方端に結合した、リンカー及び前記捕捉用配列を含む捕捉用タグ(Pt)を含み、前記他方端で固相担体に固定されており、且つ、
前記タグ付鋳型二本鎖DNAのクローンごとに前記固相担体の特定の微小表面に固定化されている、RNAアプタマーのスクリーニング用ライブラリ。

【請求項13】
 
前記タグ付鋳型二本鎖DNAから転写された、前記捕捉用配列の相補配列が付加された前記RNAアプタマー候補が、前記捕捉用タグ(Pt)に相補結合することでRNA/DNA複合体を構成している、請求項12に記載のRNAアプタマーのスクリーニング用ライブラリ。

【請求項14】
 
前記固相担体が微粒子担体であり、前記微小表面が前記微粒子担体の表面である、請求項12又は13に記載のRNAアプタマーのスクリーニング用ライブラリ。

【請求項15】
 
前記固相担体が基板担体であり、前記微小表面が前記基板担体の表面上の特定の微小領域である、請求項12又は13に記載のRNAアプタマーのスクリーニング用ライブラリ。
IPC(International Patent Classification)
F-term
State of application right Published
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