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遺伝子特異的非バイアス増幅法 UPDATE 新技術説明会 外国出願あり

国内特許コード P200016919
掲載日 2020年5月22日
出願番号 特願2017-502372
出願日 平成28年2月23日(2016.2.23)
国際出願番号 JP2016055192
国際公開番号 WO2016136716
国際出願日 平成28年2月23日(2016.2.23)
国際公開日 平成28年9月1日(2016.9.1)
優先権データ
  • 特願2015-033236 (2015.2.23) JP
発明者
  • 小笠原 康悦
出願人
  • 国立大学法人東北大学
発明の名称 遺伝子特異的非バイアス増幅法 UPDATE 新技術説明会 外国出願あり
発明の概要 本発明は、標的遺伝子をバイアスをかけずに増幅する方法、及びそのために用いるアダプターDNAの提供を目的とし、本発明は、以下の特徴を有する非バイアス遺伝子増幅に用いる2本鎖アダプターDNAである:
(a) センス鎖とアンチセンス鎖がアニーリングしており、センス鎖とアンチセンス鎖の塩基長は同じであるか、又はセンス鎖が長い;
(b) センス鎖の塩基長は15~40bpである;
(c) アンチセンス鎖に複数のウラシルを含み、ウラシルDNAグリコシラーゼ(UNG)でアダプターを処理することにより、ウラシルが除去され、その後加熱処理することによりアンチセンス鎖が分解される;
(d) アダプターDNAの少なくとも1端は平滑末端の形態を有する;
(e) 一方の末端で増幅しようとする標的遺伝子に結合する;及び
(f) センス鎖の一部又は全部が遺伝子増幅に用いるフォワードプライマーの配列である。
従来技術、競合技術の概要

従来、特定遺伝子を増幅させる方法としてPCR法が用いられてきた。また、増幅に偏りのない非バイアス増幅のためには、アダプターを付与し、アダプターの一部と遺伝子特異的部分をプライマーとして、遺伝子増幅を行ってきた。しかし、アダプターは、DNA両端に付加されてしまうことから、アダプター部分のみでPCR増幅されてしまうことが問題であった。従来、制限酵素による消化で可能とされてきたが、技術的に問題であった。

従来技術は、アダプター部、あるいは、cDNA末端部(3'側)に制限酵素部位を挿入し、制限酵素処理を行うことで、特異的遺伝子をバイアスをかけずに増幅させる方法であった。しかし、制限酵素処理が100%ではなく、未処理DNAや、残存アダプターにより、アダプター部分のみでPCR増幅が起こってしまうという問題があった。

産業上の利用分野

本発明は、標的遺伝子を特異的に非バイアス増幅させる方法、及びそのために用いるアダプターに関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
以下の特徴を有する非バイアス遺伝子増幅に用いる2本鎖アダプターDNA:
(a) センス鎖とアンチセンス鎖がアニーリングしており、センス鎖とアンチセンス鎖の塩基長は同じであるか、又はセンス鎖が長い;
(b) センス鎖の塩基長は15~40bpである;
(c) アンチセンス鎖に複数のウラシルを含み、ウラシルDNAグリコシラーゼ(UNG)でアダプターを処理することにより、ウラシルが除去され、その後加熱処理することによりアンチセンス鎖が分解される;
(d) アダプターDNAの少なくとも1端は平滑末端の形態を有する;
(e) 一方の末端で増幅しようとする標的遺伝子に結合する;及び
(f) センス鎖の一部又は全部が遺伝子増幅に用いるフォワードプライマーの配列である。

【請求項2】
アンチセンス鎖に含まれるウラシルの数がアンチセンス鎖の塩基数の10~25%であり、5~10塩基ごとにウラシルが存在する、請求項1記載の2本鎖アダプターDNA。

【請求項3】
アンチセンス鎖の5'末端にリン酸基が結合しており、3'末端にアミノ基が結合している、請求項1又は2に記載の2本鎖アダプターDNA。

【請求項4】
請求項1~3のいずれか1項に記載のアダプターDNAと該アダプターDNAのセンス鎖の一部又は全部の配列からなるプライマーを含む、非バイアス遺伝子増幅キット。

【請求項5】
2本鎖アダプターDNA及び2本鎖アダプターDNAのセンス鎖の一部配列からなるフォワードプライマーを用いるアダプターライゲーションPCR増幅法において、フォワードプライマーのみによる遺伝子増幅を阻害することにより、非バイアス遺伝子増幅を行うために用いる阻害プライマーであって、
(a) 該阻害プライマーの配列は、
(i) 増幅しようとする標的遺伝子のmRNAから1本鎖cDNAを合成するときに用いる、オリゴdTプライマーの5'末端にアンカー配列を連結させたアンカーオリゴdTプライマーのアンカー配列部分の全部又は一部配列からなるか、若しくは
(ii) アダプターライゲーションPCR増幅法に用いる2本鎖アダプターのセンス鎖の一部配列であって、前記のフォワードプライマーの配列より3'側に存在する配列からなり、
(b) 3'側がリン酸基、アミノ基若しくはジデオキシルNTPで修飾されている、阻害プライマー。

【請求項6】
請求項1~3のいずれか1項に記載のアダプターDNAと該アダプターDNAのセンス鎖の一部又は全部の配列からなるプライマーと請求項5記載の阻害プライマーを含む、非バイアス遺伝子増幅キット。

【請求項7】
以下の工程を含む、標的遺伝子を一方向にバイアスをかけずにPCR法により増幅させる方法:
(i) 2本鎖cDNAの両端に請求項1~4のいずれか1項に記載の2本鎖アダプターDNAをライゲーションする工程;
(ii) 2本鎖アダプターDNAをライゲーションした遺伝子をウラシルDNAグリコシラーゼ(UNG)で処理し、さらに加熱処理することによりアダプターDNAのアンチセンス鎖を分解する工程;
(iii) 2本鎖アダプターDNAのセンス鎖の一部又は全部の配列からなるフォワードプライマー及び標的遺伝子に特異的にアニーリングするリバースプライマーを用いてPCR増幅を行う工程。

【請求項8】
フォワードプライマーのみによる伸長反応は起こらず、リバースプライマーによる伸長反応が起こり、アダプターのセンス鎖の相補鎖が形成された後に、該相補鎖にフォワードプライマーがアニーリングし伸長反応が起こり、リバースプライマーによる伸長及びフォワードプライマーによる伸長がこの順序で一方向に起こる、請求項7記載の標的遺伝子を一方向にバイアスをかけずにPCR法により増幅させる方法。

【請求項9】
さらに、請求項5に記載の阻害プライマーを用いることによりフォワードプライマーのみによる伸長反応を阻害する、請求項7又は8に記載の標的遺伝子を一方向にバイアスをかけずにPCR法により増幅させる方法。

【請求項10】
T細胞又はB細胞から抽出したトータルRNAからcDNAを合成し、リバースプライマーとして、T細胞受容体(TCR)又はB細胞受容体(BCR)のC領域の配列に特異的にアニーリングするプライマーを用いてTCR遺伝子又はBCR遺伝子のレパートリーを、請求項7又は8に記載の方法により網羅的に増幅し、シーケンサーにより配列決定を行うことを含む、TCR又はBCRのレパートリーの分析方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 公開
参考情報 (研究プロジェクト等) 生体防御学
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