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質量分析用プローブ UPDATE 新技術説明会

国内特許コード P200017077
掲載日 2020年8月3日
出願番号 特願2019-119846
公開番号 特開2021-004844
出願日 令和元年6月27日(2019.6.27)
公開日 令和3年1月14日(2021.1.14)
発明者
  • 北 将樹
  • 木越 英夫
出願人
  • 国立大学法人東海国立大学機構
発明の名称 質量分析用プローブ UPDATE 新技術説明会
発明の概要 【課題】より高感度で検出できる質量分析用プローブを提供すること。
【解決手段】ピレンが-NR4R5(R4及びR5は同一又は異なって、置換されていてもよい炭化水素基を示す)で置換されてなるピレン誘導体構造を含む質量分析用プローブ。
【選択図】なし
従来技術、競合技術の概要

リガンドの標的分子の同定および結合様式の解明は、創薬やケミカルバイオロジーの研究で重要である。リガンド-標的分子複合体の構造は、一般にX線回折やNMRで解析されることが多いが、その不安定さ及び希少さにより適用できない場合も多い。これらの方法を補完する標的分子解析法の一つに、リガンドに反応性官能基と検出基を導入した誘導体(ケミカルプローブ)を用いる手法がある。標的分子がタンパク質の場合、ラベル化後、酵素消化と断片ペプチドのMS解析あるいはアミノ酸配列分析などにより、標的分子の種類や結合位置を推定できる。一方でケミカルプローブを用いる場合、ラベル化反応の効率や検出感度の低さが課題となっており、本手法をより高感度且つハイスループットで実施できる方法の開発が望まれている。

芳香族炭化水素であるピレン基を持つ化合物はマトリックスを使用しないラベル支援レーザー脱離イオン化による質量分析法(LA-LDI MS)で選択的に励起、検出される(非特許文献1)。しかしながら、レーザーによりdmpyがイオン化した際の強度が高過ぎて、標的分子をフラグメント化してしまうことがあり、このため、LA-LDI MSでは十分な検出感度が得られないという問題があった。本発明者はこれまでに、LA-LDI MSにおいて、非修飾のピレン基よりも約1,000倍の高感度で検出できるアミドピレン基を開発した(非特許文献2)。しかし、この検出感度は一般にペプチドの質量分析で用いられるMALDI法と比べて低感度であった。またピレン基は疎水性が高く、一般的な生体分子の脱塩・精製に用いる方法(分子ふるい・透析・逆相HPLCなど)ではピレン標識ペプチドの回収率が低く、MSにおける検出感度が低いことが大きな問題であった(非特許文献3)。

産業上の利用分野

本発明は、質量分析用プローブ等に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
一般式(1):
【化1】
(省略)
[式中:R1、R2及びR3は同一又は異なって、水素原子又は-NR4R5(R4及びR5は同一又は異なって、置換されていてもよい炭化水素基を示す)を示す(但し、R1、R2及びR3が全て水素原子である場合を除く)。R6は水素原子又はリンカー構造を示す。]
で表される化合物、その塩、又はそれらの溶媒和物からなる、質量分析用プローブ。

【請求項2】
前記R3が水素原子である、請求項1に記載の質量分析用プローブ。

【請求項3】
前記R2が水素原子である、請求項2に記載の質量分析用プローブ。

【請求項4】
前記R4及びR5がアルキル基である、請求項3に記載の質量分析用プローブ。

【請求項5】
前記リンカー構造がアジド基又はアルキン構造を含む、請求項1~3のいずれかに記載の質量分析用プローブ。

【請求項6】
一般式(2):
【化2】
(省略)
[式中:R1、R2及びR3は同一又は異なって、水素原子又は-NR4R5(R4及びR5は同一又は異なって、置換されていてもよい炭化水素基を示す)を示す(但し、R1、R2及びR3が全て水素原子である場合を除く)。]
で表される基がリンカー構造を介してリガンドに連結してなる、ラベル化リガンド。

【請求項7】
前記リンカー構造が求核性基に対する反応性基を含む、請求項6に記載のラベル化リガンド。

【請求項8】
請求項5に記載の質量分析用プローブと、アルキン構造又はアジド基が連結されてなるリガンドとを反応させる工程を含む、請求項6又は7に記載のラベル化リガンドを製造する方法。

【請求項9】
一般式(2):
【化3】
(省略)
[式中:R1、R2及びR3は同一又は異なって、水素原子又は-NR4R5(R4及びR5は同一又は異なって、置換されていてもよい炭化水素基を示す)を示す(但し、R1、R2及びR3が全て水素原子である場合を除く)。]
で表される基が直接又はリンカー構造を介してタンパク質に連結してなる、ラベル化タンパク質。

【請求項10】
請求項7に記載のラベル化リガンドと、求核性基を有する標的タンパク質とを結合させて、前記反応性基と前記求核性基との反応を経て、前記一般式(2)で表される基をリンカー構造を介して前記標的タンパク質に連結させる工程を含む、請求項9に記載のラベル化タンパク質を製造する方法。

【請求項11】
一般式(2):
【化4】
(省略)
[式中:R1、R2及びR3は同一又は異なって、水素原子又は-NR4R5(R4及びR5は同一又は異なって、置換されていてもよい炭化水素基を示す)を示す(但し、R1、R2及びR3が全て水素原子である場合を除く)。]
で表される基が直接又はリンカー構造を介してペプチドに連結してなる、ラベル化ペプチド。

【請求項12】
請求項9に記載のラベル化タンパク質を断片化する工程を含む、請求項11に記載のラベル化ペプチドを製造する方法。

【請求項13】
一般式(2):
【化5】
(省略)
[式中:R1、R2及びR3は同一又は異なって、水素原子又は-NR4R5(R4及びR5は同一又は異なって、置換されていてもよい炭化水素基を示す)を示す(但し、R1、R2及びR3が全て水素原子である場合を除く)。]
で表される基が連結してなるラベル化分子を含有する混合物をポリスチレン担体に接触させる工程を含む、前記ラベル化分子の精製方法。

【請求項14】
一般式(2):
【化6】
(省略)
[式中:R1、R2及びR3は同一又は異なって、水素原子又は-NR4R5(R4及びR5は同一又は異なって、置換されていてもよい炭化水素基を示す)を示す(但し、R1、R2及びR3が全て水素原子である場合を除く)。]
で表される基が連結してなるラベル化分子をイオン化し、その質量電荷比を測定する工程を含む、質量分析方法。

【請求項15】
抗ベンゾピレン抗体を含有する、一般式(2):
【化7】
(省略)
[式中:R1、R2及びR3は同一又は異なって、水素原子又は-NR4R5(R4及びR5は同一又は異なって、置換されていてもよい炭化水素基を示す)を示す(但し、R1、R2及びR3が全て水素原子である場合を除く)。]
で表される基が連結してなるラベル化分子の検出剤。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 公開


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