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(In Japanese)インターフェロンβ産生細胞の作製方法

Patent code P200017157
File No. (S2017-0576-N0)
Posted date Aug 27, 2020
Application number P2019-510249
Date of filing Mar 30, 2018
International application number JP2018013617
International publication number WO2018181903
Date of international filing Mar 30, 2018
Date of international publication Oct 4, 2018
Priority data
  • P2017-071596 (Mar 31, 2017) JP
Inventor
  • (In Japanese)千住 覚
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人熊本大学
Title (In Japanese)インターフェロンβ産生細胞の作製方法
Abstract (In Japanese)発明の目的は、インターフェロンβ生産性の高いiPS-MLの作製方法を提供することである。本発明により、IFNAR遺伝子の発現を抑制する工程及び該細胞においてインターフェロンβ遺伝子を導入する工程を含む、インターフェロンβ生産性の高いミエロイド系血液細胞の作製方法が提供される。また本発明により、外来性のインターフェロン(IFN)βを発現しかつインターフェロンα/β受容体の発現が抑制されたミエロイド系血液細胞を含む、癌の予防又は治療剤が提供される。
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

iPS-MC(iPS cell-derived myeloid cell:単球あるいはマクロファージ類似細胞)は、ヒトのiPS細胞をin vitroの培養系において分化誘導することにより作成されるミエロイド系血液細胞である。iPS-ML(長期増殖能を有するiPS-MC)は、iPS-MCに細胞増殖因子(例、cMYC+BMI1+MDM2)の遺伝子を導入し増殖能力を付与したものである。iPS-MLは、一度樹立すると、少なくとも3~4ヶ月にわたり増殖させることが可能である。そして、増殖後も、ミエロイド系細胞のマーカー分子の発現、異物貪食能力、および樹状細胞への分化能力等の特性を保持している(特許文献1)。iPS-MLは、単純な浮遊細胞培養系を用いて増殖させることが可能であり、自動大量培養装置を用いた培養も可能である。以上より、iPS-ML作製技術は、生理的な機能を有するヒトミエロイド細胞の大量生産を可能とする唯一のものであると言える。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、インターフェロンβ生産性の高い細胞、及びインターフェロンβ生産性の高い細胞の作製方法に関し、さらに該細胞を含む癌の予防又は治療剤、並びに該細胞を用いた癌の予防又は治療方法に関するものである。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
ミエロイド系血液細胞から、インターフェロン(IFN)β生産性の高いミエロイド系血液細胞を作製する方法であって、下記の工程(B)及び(C)を含む方法:
(B)ミエロイド系血液細胞において、インターフェロンα/β受容体(IFNAR)遺伝子の発現を抑制する工程、
(C)プロモーターと機能的に連結されたIFNβ遺伝子を、ミエロイド系血液細胞に導入する工程。

【請求項2】
 
ミエロイド系血液細胞が、多能性幹細胞に由来するミエロイド系血液細胞である、請求項1に記載の方法。

【請求項3】
 
多能性幹細胞からIFNβ生産性の高いミエロイド系血液細胞を作製する方法であって、下記の工程(A)、(B)及び(C)を含む方法:
(A)多能性幹細胞からミエロイド系血液細胞を作製する工程、
(B)IFNAR遺伝子の発現を抑制する工程、及び
(C)プロモーターと機能的に連結されたインターフェロンβ遺伝子を導入する工程を含む、方法。

【請求項4】
 
工程(B)におけるIFNAR遺伝子の発現の抑制が、IFNARの遺伝子破壊である、請求項1~3のいずれか一項に記載の方法。

【請求項5】
 
工程(B)におけるIFNAR遺伝子の発現の抑制が、IFNAR1遺伝子のエクソン1~3のいずれか及び/又はIFNAR2遺伝子のエクソン2~4のいずれかへのdouble strand break(DSB)の導入による、フレームシフト及び/又はストップコドンの挿入による遺伝子破壊による、請求項1~4のいずれかに記載の方法。

【請求項6】
 
工程(B)におけるIFNAR遺伝子の発現の抑制が、IFNAR1遺伝子のエクソン2及び/又はIFNAR2遺伝子のエクソン3へのdouble strand break(DSB)の導入による、フレームシフト及び/又はストップコドンの挿入による遺伝子破壊による、請求項1~4のいずれか一項に記載の方法。

【請求項7】
 
工程(B)におけるIFNAR遺伝子の遺伝子破壊が、配列番号1及び/又は7を標的とするガイドRNAを用いたCRISPR/CAS9系を用いたものである、請求項5又は6に記載の方法。

【請求項8】
 
工程(C)におけるプロモーターと機能的に連結されたIFNβ遺伝子が、外来性プロモーターと機能的に連結された外来性IFNβ遺伝子である、請求項1~7のいずれか一項に記載の方法。

【請求項9】
 
ミエロイド系血液細胞が、下記の(a)及び(b)の外来性遺伝子を発現する、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法:
(a)c-MYC遺伝子、
(b)B cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site 1(BMI1)遺伝子、Enhancer of zeste homolog 2 (EZH2)遺伝子、MDM2遺伝子、MDM4遺伝子及びHypoxia Inducible Factor 1 Alpha Subunit(HIF1A)遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子。

【請求項10】
 
下記の(a)及び(b)の外来性遺伝子を導入する工程をさらに含む、請求項1~8のいずれか一項に記載の方法:
(a)c-MYC遺伝子、
(b)B cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site 1(BMI1)遺伝子、Enhancer of zeste homolog 2 (EZH2)遺伝子、MDM2遺伝子、MDM4遺伝子及びHypoxia Inducible Factor 1 Alpha Subunit(HIF1A)遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子。

【請求項11】
 
請求項1~10のいずれか一項に記載の方法により得られるミエロイド系血液細胞のIFNβ産生量を測定し、IFNβ産生量の高いミエロイド系血液細胞を選択する工程を含む、IFNβ生産性の高いミエロイド系血液細胞の作製方法。

【請求項12】
 
内在性のIFNAR遺伝子の発現が抑制されており、かつ、外来性プロモーターと機能的に連結された外来性IFNβ遺伝子を有する、ミエロイド系血液細胞。

【請求項13】
 
下記の(a)及び(b)の外来性遺伝子をさらに含む、請求項12に記載の細胞:
(a)c-MYC遺伝子、
(b)B cell-specific Moloney murine leukemia virus integration site 1(BMI1)遺伝子、Enhancer of zeste homolog 2 (EZH2)遺伝子、MDM2遺伝子、MDM4遺伝子及びHypoxia Inducible Factor 1 Alpha Subunit(HIF1A)遺伝子からなる群から選択される少なくとも一つの遺伝子。

【請求項14】
 
CD11b陽性かつCD45陽性である、請求項12又は13に記載の細胞。

【請求項15】
 
IFNβ生産量が50 ng/106細胞/24時間以上である、請求項12~14のいずれか一項に記載の細胞。

【請求項16】
 
予防又は治療上有効量の請求項12~15のいずれか一項に記載の細胞又は請求項1~11のいずれか一項に記載の方法を用いて作製された細胞を含む、がんの予防又は治療剤。

【請求項17】
 
予防又は治療上有効量の請求項12~15のいずれか一項に記載の細胞又は請求項1~11のいずれか一項に記載の方法を用いて作製された細胞を投与することを含む、がんの予防又は治療方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2019510249thum.jpg
State of application right Published
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