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cDNAの製造方法 UPDATE

国内特許コード P200017249
整理番号 N1-19006-T
掲載日 2020年10月20日
出願番号 特願2020-024537
公開番号 特開2020-150937
出願日 令和2年2月17日(2020.2.17)
公開日 令和2年9月24日(2020.9.24)
優先権データ
  • 特願2019-045901 (2019.3.13) JP
発明者
  • 鹿島 誠
  • 永野 惇
出願人
  • 学校法人龍谷大学
発明の名称 cDNAの製造方法 UPDATE
発明の概要 【課題】高価な試薬を用いることなく簡便な操作により、植物試料に含まれるRNAからcDNAを製造する方法を提供する。
【解決手段】下記工程(1)~(2):(1)還元剤を10mM以上の濃度で含む破砕溶液中で植物試料を破砕する破砕工程、並びに(2)前記破砕物、及び逆転写酵素を含む、体積が3μL以上の溶液中で逆転写反応を行う逆転写工程を含み、前記植物試料又は前記破砕物からの核酸の精製を行わない、cDNAの製造方法。
【選択図】なし
従来技術、競合技術の概要

生物の遺伝子発現を調べるための一般的な手法として、RT-qPCRやRNA-Seqが用いられている。これらの手法は定量性や網羅性に優れており、理学・農学・医学の幅広い分野で使用されている。

RT-qPCRやRNA-Seqを行うためには、その前段階として生体試料からRNAを抽出・精製する必要がある。特に、植物試料には多糖類等の夾雑物が多く含まれるため、植物試料由来からRNAを取得する際には特に厳密なRNA抽出を行う必要がある。近年、RT-qPCRやRNA-Seqに必要な費用が低下しているのに対し、RNAの抽出・精製には依然として一検体あたり五百円から千円ほどの費用が必要であり、その低減が求められている。

RNAはRNase(RNA分解酵素)により極めて容易に分解されてしまうので、高品質なRNAを得るためには生体由来のRNaseを阻害・除去することも必要である。RNaseを阻害する方法としては、乾熱滅菌、グアニジン塩酸塩による処理、RNaseを特異的に阻害するタンパク質(RNase inhibitor等)の添加等が知られている。しかし、乾熱滅菌ではRNaseだけではなくRNAも分解されてしまう。グアニジン塩酸塩は、RNA調整後に使用する逆転写酵素等の酵素の反応も阻害してしまう。RNaseを特異的に阻害するタンパク質は一般に高価である。

RNA抽出・精製を省略して、組織破砕液から直接逆転写を行うことができれば、RNAの抽出・精製にかかるコストを削減できる。そのためには、RNA精製後の逆転写反応に用いる酵素を阻害しないRNA調製溶液を開発する必要がある。しかし、逆転写酵素とRNaseはいずれもタンパク質であるため、逆転写酵素は阻害することなくRNaseを阻害することは容易ではない。

特許文献1は、顕微鏡下で観察しながら、スライドガラス上で単一細胞に含まれる核酸を増幅する方法を開示している。しかし、動物由来の培養細胞を顕微鏡下で観察しながら増幅するため、生体試料を含有する液体の総液量はごく微量である。該方法は遺伝子発現量の定量を目的としたものではないため、得られたRNAをRT-qPCRやRNA-Seqに用いることはできない。

特許文献2は、固定生体試料からのRNAおよびDNAの並行単離・精製方法を開示している。しかし、固定生体試料からの単離・精製であるため、固定生体試料破砕液から直接逆転写を行うことはできない。非特許文献1は還元剤がRNaseを阻害することを記載しているが、多様な夾雑物を含む組織破砕液中で還元剤がRNaseを阻害できるか不明であり、また、逆転写酵素への影響も不明である。非特許文献2は、還元剤を含むバッファー中で動物由来の培養細胞からRNAを精製する方法を開示している。しかし、この方法を、細胞壁を有する植物細胞同士が強固に結合した植物試料に適用できるかどうかは不明である。

産業上の利用分野

本発明は、cDNAの製造方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
下記工程(1)~(2):
(1)還元剤を10mM以上の濃度で含む破砕溶液中で植物試料を破砕する破砕工程、並びに
(2)前記破砕物、及び逆転写酵素を含む、体積が3μL以上の溶液中で逆転写反応を行う逆転写工程
を含み、前記植物試料又は前記破砕物からの核酸の精製を行わない、
cDNAの製造方法。

【請求項2】
前記破砕溶液中の還元剤の濃度が10~1000mMである、請求項1に記載のcDNAの製造方法。

【請求項3】
前記破砕溶液のpHが5.2~8.5である、請求項1又は2に記載のcDNAの製造方法。

【請求項4】
前記還元剤がDTT、2-メルカプトエタノール、グルタチオン、水素化ホウ素ナトリウム、シアン化水素化ホウ素ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、次亜硫酸ナトリウム、ピロ亜硫酸カリウム、チオ硫酸ナトリウム、アスコルビン酸、1-チオグリセロール、システイン、トリブチルホスフィン、アミノエタンチオール、及びトリス2-カルボキシエチルホスフィンからなる群から選択される1以上である、請求項1~3のいずれか1項に記載のcDNAの製造方法。
国際特許分類(IPC)
Fターム
出願権利状態 公開
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