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water-in-oilエマルション培養における蛍光を用いた細胞増殖検出方法 NEW

国内特許コード P200017355
整理番号 (2017002067)
掲載日 2020年12月22日
出願番号 特願2019-548165
出願日 平成30年10月4日(2018.10.4)
国際出願番号 JP2018037257
国際公開番号 WO2019073902
国際出願日 平成30年10月4日(2018.10.4)
国際公開日 平成31年4月18日(2019.4.18)
優先権データ
  • 特願2017-197980 (2017.10.11) JP
発明者
  • 大田 悠里
  • 斉藤 加奈子
  • ▲高▼木 妙子
  • 常田 聡
  • 宮本 龍樹
  • 森田 雅宗
  • 松倉 智子
  • 野田 尚宏
出願人
  • 国立研究開発法人産業技術総合研究所
発明の名称 water-in-oilエマルション培養における蛍光を用いた細胞増殖検出方法 NEW
発明の概要 微生物が増殖したドロップレットを非侵襲的に検出・分取を可能とする方法の提供を課題とする。
本発明は、ドロップレット内の微生物の増殖を検出する方法であって、(a)微生物を含むドロップレットを作製する工程と、(b)ドロップレット中で微生物を培養する工程と、(c)ドロップレット内の微生物の増殖を検出する工程であって、(c1)微生物より体外に分泌または放出された物質に作用して蛍光を生じる蛍光修飾核酸プローブを用いて、蛍光修飾核酸プローブが生じる蛍光を測定するか、または、(c2)微生物の自家蛍光を測定する工程とを含み、蛍光が検出された前記ドロップレットは、インタクトの微生物を含む、検出方法に関する。
従来技術、競合技術の概要

環境中には様々な微生物が生息しており、私たちはこれら微生物の活性や微生物が産生する物質を利用してきた。しかしながら、環境中の微生物の99%は未だ培養に成功しておらず、生物資源の多くは手付かずのままとなっている。これら未知微生物を培養することで、環境中での微生物の生理学的特性を明らかにするだけでなく、医学・産業の発展にも応用されることが期待される。
近年、微生物の分離・培養法の一つとして、W/Oエマルションを用いた手法が注目されつつある(非特許文献1および非特許文献2)。本手法では、油相中に水滴(微生物培養培地を使用)を分散させ、各水滴(ドロップレット)を一つの培養場として用いる。マイクロ流路を用いることにより、数分で数十万~数百万単位のドロップレットを作製することが可能となりハイスループット化が見込まれる。また、水相中に存在する微生物数とドロップレット数の調整により、一細胞が封入されたドロップレットを作ることができれば、シングルセルからの培養が可能となる(非特許文献3)。
本手法を用いて微生物を培養する場合、1つのドロップレットあたりの細胞数はポワソン分布に従う。1つのドロップレットに一細胞が入る確率を高くしていくにつれ、微生物が存在しないドロップレットが生じる確率も高くなる。この時、微生物の増殖が見られるドロップレットを選択的に分取することができれば各微生物の解析、スケールアップ等に活用できる。微生物が存在するドロップレットの検出には細胞内分子と反応する蛍光基質が使用されてきたが、これらは同時に細胞破砕が必要となるので、微生物を生きたまま分取することができない(非特許文献4、非特許文献5)。

産業上の利用分野

本発明は、water-in-oil(W/O)エマルションを用いた微生物の培養・検出・分取の方法に関する。特に、微生物が増殖したドロップレットを見出す手法として、微生物による自家蛍光を用いた手法およびシグナル検出用レポーター分子として蛍光修飾核酸を用いた方法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
W/Oエマルションにおけるドロップレット内の微生物の増殖を検出する方法であって、
(a)微生物を含むドロップレットを作製する工程と
(b)前記ドロップレット中で微生物を培養する工程と
(c)前記ドロップレット内の微生物の増殖を検出する工程であって、前記微生物より体外に分泌または放出された物質に作用して蛍光特性の変化を生じる蛍光修飾核酸プローブを用いて、前記蛍光修飾核酸プローブが生じる蛍光を測定する工程と
を含み、
蛍光特性の変化が検出された前記ドロップレットが、インタクトかつ増殖した微生物を含むドロップレットであることを示す、検出方法。

【請求項2】
請求項1に記載の検出方法であって、
前記(c)の検出工程における前記蛍光修飾核酸プローブが前記微生物より体外に分泌または放出されたRNaseまたはDNaseの作用により蛍光特性に変化を生じるものである、検出方法。

【請求項3】
請求項1または2に記載の検出方法であって、
前記(c)の検出工程がマイクロ流路上で行われる、検出方法。

【請求項4】
請求項1~3のいずれか一項に記載の検出方法であって、
前記微生物が環境由来である、検出方法。

【請求項5】
請求項1~4のいずれか一項に記載の検出方法であって、
前記微生物が人工的に作製されたものではない、検出方法。

【請求項6】
請求項1~3のいずれか一項に記載の検出方法であって、
前記微生物が遺伝子組換え微生物である、検出方法。

【請求項7】
請求項1~6のいずれか一項に記載の検出方法であって、
前記(a)ドロップレットを作製する工程が、二種以上の微生物を含むドロップレットを作製する工程である、検出方法。

【請求項8】
請求項1~7のいずれか一項に記載の検出方法であって、
前記(a)ドロップレットを作製する工程が、微生物を一細胞単位で含むドロップレットを作製する工程であって、
前記(c)の検出工程において蛍光特性の変化が検出された前記ドロップレットが、インタクトかつ増殖した微生物であって、単一の細胞由来の微生物を含むものである、検出方法。

【請求項9】
請求項1~8のいずれか一項に記載の検出方法であって、
前記(c)の検出工程において前記蛍光修飾核酸プローブは、
(ア)前記(a)のドロップレットの作製工程において、ドロップレット中に封入されるか、または、
(イ)前記(c)の検出工程の前に、微生物を含むドロップレットと蛍光修飾核酸プローブを含むドロップレットとを合一させることにより、微生物を含むドロップレット中に封入される、検出方法。

【請求項10】
請求項9に記載の検出方法であって、
前記蛍光修飾核酸プローブがFRET型蛍光修飾核酸プローブである、検出方法。

【請求項11】
W/Oエマルションからインタクトかつ増殖した微生物を含むドロップレットを回収する方法であって、
(i)微生物を含むドロップレットを作製する工程と
(ii)前記ドロップレット中で微生物を培養する工程と
(iii)前記ドロップレット内の微生物の増殖を検出する工程であって、
前記微生物より分泌または放出された物質に作用して蛍光特性に変化を生じる蛍光修飾核酸プローブを用いて、前記蛍光修飾核酸プローブが生じる蛍光を測定するか、または、
微生物の自家蛍光を測定する工程と
(iv)蛍光特性の変化を検出したドロップレットを回収する工程と
を含む、回収方法。

【請求項12】
請求項11に記載の回収方法であって、
前記(iii)および(iv)の工程をさらに1回または複数回繰り返す、回収方法。

【請求項13】
請求項11または12に記載の回収方法であって、前記(iv)の回収工程の後に
(v)前記ドロップレットから微生物を回収することを含む、回収方法。

【請求項14】
請求項1~10のいずれか一項に記載の検出方法、または、請求項11~13のいずれか一項に記載の回収方法に使用されるキットであって、
W/Oエマルション水相用の培養液と
W/Oエマルション油相用の油成分と
W/Oエマルションを安定化するための界面活性剤と
蛍光修飾核酸プローブと
を含む、キット。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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JP2019548165thum.jpg
出願権利状態 公開
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