(In Japanese)water－in－oilエマルション培養における蛍光を用いた細胞増殖検出方法
| Patent code | P200017355 |
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| File No. | (2017002067) |
| Posted date | Dec 22, 2020 |
| Application number | P2019-548165 |
| Date of filing | Oct 4, 2018 |
| International application number | JP2018037257 |
| International publication number | WO2019073902 |
| Date of international filing | Oct 4, 2018 |
| Date of international publication | Apr 18, 2019 |
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| Inventor |
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| Applicant |
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| Title | (In Japanese)water－in－oilエマルション培養における蛍光を用いた細胞増殖検出方法 |
| Abstract |
(In Japanese)微生物が増殖したドロップレットを非侵襲的に検出・分取を可能とする方法の提供を課題とする。 本発明は、ドロップレット内の微生物の増殖を検出する方法であって、（a）微生物を含むドロップレットを作製する工程と、（b）ドロップレット中で微生物を培養する工程と、（c）ドロップレット内の微生物の増殖を検出する工程であって、（c1）微生物より体外に分泌または放出された物質に作用して蛍光を生じる蛍光修飾核酸プローブを用いて、蛍光修飾核酸プローブが生じる蛍光を測定するか、または、（c2）微生物の自家蛍光を測定する工程とを含み、蛍光が検出された前記ドロップレットは、インタクトの微生物を含む、検出方法に関する。 |
| Outline of related art and contending technology |
(In Japanese) 環境中には様々な微生物が生息しており、私たちはこれら微生物の活性や微生物が産生する物質を利用してきた。しかしながら、環境中の微生物の99%は未だ培養に成功しておらず、生物資源の多くは手付かずのままとなっている。これら未知微生物を培養することで、環境中での微生物の生理学的特性を明らかにするだけでなく、医学・産業の発展にも応用されることが期待される。 |
| Field of industrial application |
(In Japanese) 本発明は、water-in-oil(W/O)エマルションを用いた微生物の培養・検出・分取の方法に関する。特に、微生物が増殖したドロップレットを見出す手法として、微生物による自家蛍光を用いた手法およびシグナル検出用レポーター分子として蛍光修飾核酸を用いた方法に関する。 |
| Scope of claims |
(In Japanese) 【請求項1】 W/Oエマルションにおけるドロップレット内の微生物の増殖を検出する方法であって、 （a）微生物を含むドロップレットを作製する工程と （b）前記ドロップレット中で微生物を培養する工程と （c）前記ドロップレット内の微生物の増殖を検出する工程であって、前記微生物より体外に分泌または放出された物質に作用して蛍光特性の変化を生じる蛍光修飾核酸プローブを用いて、前記蛍光修飾核酸プローブが生じる蛍光を測定する工程と を含み、 蛍光特性の変化が検出された前記ドロップレットが、インタクトかつ増殖した微生物を含むドロップレットであることを示す、検出方法。 【請求項2】 請求項1に記載の検出方法であって、 前記（c）の検出工程における前記蛍光修飾核酸プローブが前記微生物より体外に分泌または放出されたRNaseまたはDNaseの作用により蛍光特性に変化を生じるものである、検出方法。 【請求項3】 請求項1または2に記載の検出方法であって、 前記（c）の検出工程がマイクロ流路上で行われる、検出方法。 【請求項4】 請求項1～3のいずれか一項に記載の検出方法であって、 前記微生物が環境由来である、検出方法。 【請求項5】 請求項1～4のいずれか一項に記載の検出方法であって、 前記微生物が人工的に作製されたものではない、検出方法。 【請求項6】 請求項1～3のいずれか一項に記載の検出方法であって、 前記微生物が遺伝子組換え微生物である、検出方法。 【請求項7】 請求項1～6のいずれか一項に記載の検出方法であって、 前記（a）ドロップレットを作製する工程が、二種以上の微生物を含むドロップレットを作製する工程である、検出方法。 【請求項8】 請求項1～7のいずれか一項に記載の検出方法であって、 前記（a）ドロップレットを作製する工程が、微生物を一細胞単位で含むドロップレットを作製する工程であって、 前記（c）の検出工程において蛍光特性の変化が検出された前記ドロップレットが、インタクトかつ増殖した微生物であって、単一の細胞由来の微生物を含むものである、検出方法。 【請求項9】 請求項1～8のいずれか一項に記載の検出方法であって、 前記（c）の検出工程において前記蛍光修飾核酸プローブは、 （ア）前記（a）のドロップレットの作製工程において、ドロップレット中に封入されるか、または、 （イ）前記（c）の検出工程の前に、微生物を含むドロップレットと蛍光修飾核酸プローブを含むドロップレットとを合一させることにより、微生物を含むドロップレット中に封入される、検出方法。 【請求項10】 請求項9に記載の検出方法であって、 前記蛍光修飾核酸プローブがFRET型蛍光修飾核酸プローブである、検出方法。 【請求項11】 W/Oエマルションからインタクトかつ増殖した微生物を含むドロップレットを回収する方法であって、 （i）微生物を含むドロップレットを作製する工程と （ii）前記ドロップレット中で微生物を培養する工程と （iii）前記ドロップレット内の微生物の増殖を検出する工程であって、 前記微生物より分泌または放出された物質に作用して蛍光特性に変化を生じる蛍光修飾核酸プローブを用いて、前記蛍光修飾核酸プローブが生じる蛍光を測定するか、または、 微生物の自家蛍光を測定する工程と （iv）蛍光特性の変化を検出したドロップレットを回収する工程と を含む、回収方法。 【請求項12】 請求項11に記載の回収方法であって、 前記（iii）および（iv）の工程をさらに1回または複数回繰り返す、回収方法。 【請求項13】 請求項11または12に記載の回収方法であって、前記（iv）の回収工程の後に （v）前記ドロップレットから微生物を回収することを含む、回収方法。 【請求項14】 請求項1～10のいずれか一項に記載の検出方法、または、請求項11～13のいずれか一項に記載の回収方法に使用されるキットであって、 W/Oエマルション水相用の培養液と W/Oエマルション油相用の油成分と W/Oエマルションを安定化するための界面活性剤と 蛍光修飾核酸プローブと を含む、キット。 |
| IPC(International Patent Classification) |
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| F-term |
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Drawing
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| State of application right | Published |
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