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(In Japanese)改変されたコラーゲンタンパク質およびその用途

Patent code P210017405
File No. (S2018-0110-N0)
Posted date Jan 27, 2021
Application number P2019-554262
Date of filing Nov 14, 2018
International application number JP2018042181
International publication number WO2019098246
Date of international filing Nov 14, 2018
Date of international publication May 23, 2019
Priority data
  • P2017-219515 (Nov 14, 2017) JP
Inventor
  • (In Japanese)三輪 佳宏
  • (In Japanese)木嶋 順子
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人筑波大学
Title (In Japanese)改変されたコラーゲンタンパク質およびその用途
Abstract (In Japanese)コラーゲンタンパク質の改変およびそれを応用した、研究または治療法開発を含む各種用途に有用なツール、方法等の開発等のために、本発明は、形質転換細胞で発現され、当該細胞外にてコラーゲン線維を形成することができる改変されたコラーゲンタンパク質であって、上記形質転換が、上記改変されたコラーゲンタンパク質をコードするポリヌクレオチドの上記細胞への導入によるものである、改変されたコラーゲンタンパク質を提供する。
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

組織の線維化は、炎症や損傷に伴って起こる創傷治癒が過剰になり、結合組織が正常組織に置き換わることで発生し、臓器や組織の機能低下を引き起こす(例えば、肺においては間質性肺炎、感染症、肺炎等(喫煙が原因になり得る);肝臓においては、脂肪肝等(ウイルス感染、アルコール等が原因になり得る);腎臓においては、糖尿病末期等;心臓においては、心不全等;あるいは術後の癒着など)。種々の疾患の特に末期に発生しやすく、臓器不全の主要な原因である。これらの発生の解析には、実験動物の解剖(すなわち、侵襲的方法)による一連の解析が必要である。

従来、コラーゲンタンパク質のN末端またはC末端は細胞外に分泌される際に切断・除去され、長いコラーゲンポリペプチドの中央部分(3量体ヘリックス部分)だけが線維形成に関与するため、N末端またはC末端に蛍光タンパク質などを付加したイメージングでは、細胞内での輸送過程しか検出できず、細胞外に出る時点で切断後のコラーゲン線維を可視化することは不可能であった。

また、線維形成に関与する3量体ヘリックス部分は種間で保存された部分であり、構造的に安定であるため、この部分に他のタンパク質を挿入することは困難であった。(図1; 非特許文献1:Prockop DJ et al., New Engl J Med, Vol.301, 13-23, 1979)したがって、一般的な融合タンパク質の手法での標識化は困難であった。

線維化の成分であるType I、III、V、XIコラーゲンのうちで、TypeVおよびXIコラーゲンは例外的に切断されないN末端ドメインを有し、特に、Type Iなどの他のコラーゲンと集合して太い線維を形成する際に、Type VコラーゲンのN末端ドメインは線維の外側に配列されると考えられている(図2; 非特許文献2: Simone M. Smith and David E. Birk, Exp Eye Res Vol.98, 105-106, 2012)

ヒト・コラーゲン発現ベクターおよびヒト・コラーゲンの製造方法が、特許文献において報告されている(特許文献1:特開平08-023979号公報)。この文献では、ヒト3型コラーゲン遺伝子の全長をそのままベクターに組み込んで発現させることが報告されており、電気泳動上は正しいタンパク質が合成されているようであるが、細胞外に本来のコラーゲン線維を形成しているかどうかについては記載されていない。そもそもsf9細胞は他の種類のコラーゲンを産生しておらず、この細胞を用いて正しいコラーゲン線維形成はできないであろうと思われる。また、生体組織分析用プローブ及びその利用法を報告する文献もある(特許文献2:WO2012/124338)。この文献は、コラーゲン分解酵素のコラーゲン結合ドメインに蛍光タンパク質などを付加したプローブを開示する。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、コラーゲンタンパク質の改変技術およびそれを利用したコラーゲンタンパク質の新規用途に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
形質転換細胞で発現され、前記細胞外にてコラーゲン線維を形成することができる改変されたコラーゲンタンパク質であって、前記形質転換が、前記改変されたコラーゲンタンパク質をコードするポリヌクレオチドの前記細胞への導入によるものである、改変されたコラーゲンタンパク質。

【請求項2】
 
請求項1に記載の改変されたコラーゲンタンパク質であって、前記改変が、前記コラーゲンをコードするヌクレオチド配列への前記コラーゲンとは異なるタンパク質をコードするポリヌクレオチドの挿入または付加によるものである、改変されたコラーゲンタンパク質。

【請求項3】
 
前記挿入または付加が、コラーゲンタンパク質のN末端側またはC末端側の領域に対応する領域内の部位においてなされたものである、請求項1または2に記載の改変されたコラーゲンタンパク質。

【請求項4】
 
前記コラーゲンとは異なるタンパク質が、標識用タンパク質および治療用タンパク質からなる群から選択される、請求項1~3のいずれか一項に記載の改変されたコラーゲンタンパク質。

【請求項5】
 
前記標識用タンパク質が、蛍光タンパク質(例:GFP、iRFP、HaloTag7)または発光タンパク質(例:ルシフェラーゼ(遺伝子例:Luc(+), Luc2、CBGluc、CBRluc、ELuc、SLR、SLO、SLG))であり、前記治療用タンパク質が、抗体または特殊ペプチドである、請求項4に記載の改変されたコラーゲンタンパク質。

【請求項6】
 
前記コラーゲンが、Type VコラーゲンまたはType XIコラーゲンである、請求項1~5のいずれか一項に記載の改変されたコラーゲンタンパク質。

【請求項7】
 
前記コラーゲンが、Type V α1、Type V α3、Type XI α1、またはType XI α2コラーゲンである、請求項6に記載の改変されたコラーゲンタンパク質。

【請求項8】
 
請求項1~7のいずれか一項に記載の改変されたコラーゲンタンパク質であって、配列番号2および配列番号4からなる群から選択されるアミノ酸配列またはそれに対して少なくとも90%の同一性を有するアミノ酸配列を含む、改変されたコラーゲンタンパク質。

【請求項9】
 
請求項1~8のいずれか一項に記載の改変されたコラーゲンタンパク質をコードするポリヌクレオチド。

【請求項10】
 
配列番号1および配列番号3からなる群から選択されるヌクレオチド配列またはそれに対して少なくとも90%の同一性を有するヌクレオチド配列からなる、請求項9に記載のポリヌクレオチド。

【請求項11】
 
請求項9または10に記載のポリヌクレオチドを含む発現ベクター。

【請求項12】
 
請求項9もしくは10に記載のポリヌクレオチド、または請求項11に記載の発現ベクターが導入された発現細胞株。

【請求項13】
 
請求項12に記載の発現細胞株をコートしたコラーゲンコートディッシュ。

【請求項14】
 
請求項1~8のいずれか一項に記載の改変されたコラーゲンタンパク質または請求項9もしくは10に記載のポリヌクレオチドを含む薬物送達ビヒクル。

【請求項15】
 
請求項1~8のいずれか一項に記載の改変されたコラーゲンタンパク質または請求項9もしくは10に記載のポリヌクレオチドを含む組成物。

【請求項16】
 
請求項9もしくは10に記載のポリヌクレオチド、請求項11に記載の発現ベクター、請求項12に記載の発現細胞株、請求項14に記載のビヒクル、または請求項15に記載の組成物が導入されたモデル動物。

【請求項17】
 
前記モデル動物がマウスである、請求項16に記載のモデル動物。

【請求項18】
 
改変されたコラーゲンをコードする遺伝子を形質導入した細胞の細胞外において前記改変されたコラーゲンタンパク質を含むコラーゲン線維を形成させる方法であって、
請求項9または10に記載のポリヌクレオチドを前記細胞に導入する工程を含む、方法。

【請求項19】
 
形質導入された前記細胞をインビトロでストレス下で培養する工程を含む、請求項18に記載の方法。

【請求項20】
 
モデル動物において前記改変されたコラーゲンタンパク質を含むコラーゲン線維を形成させる工程をさらに含む、請求項18または19に記載の方法。

【請求項21】
 
前記改変されたコラーゲンタンパク質が、標識用タンパク質の挿入または付加により改変されており、
前記標識を検出するための可視化またはイメージングの工程をさらに含む、請求項18~20のいずれか一項に記載の方法。

【請求項22】
 
前記改変されたコラーゲンが、N末端ドメインとヒンジ部位との間の部位に標識用タンパク質を挿入したType Vコラーゲンα1である、請求項18~21のいずれか一項に記載の方法。

【請求項23】
 
コラーゲン分泌および/またはコラーゲン線維形成の阻害剤のスクリーニング方法であって、
請求項12に記載の発現細胞株をインビトロでストレス条件下で培養する工程であって、改変されたコラーゲンタンパク質が標識用タンパク質の挿入または付加により改変されている、工程、
前記ストレス条件下での培養の前に、前記培養物に前記阻害剤の候補物質を添加する工程、ならびに
前記候補物質の前記添加後、前記培養物において、前記細胞の細胞外においてコラーゲン分泌および/またはコラーゲン線維形成を観察し、前記コラーゲン分泌および/またはコラーゲン線維形成を、前記候補物質の前記添加がなかった場合と比較して低減させる作用を有する前記候補物質を前記阻害剤として選択する工程を含む、方法。

【請求項24】
 
前記選択する工程が、前記標識を検出するための可視化またはイメージングの工程を含む、請求項23に記載の方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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JP2019554262thum.jpg
State of application right Published
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