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DETECTION METHOD OF TARGET MOLECULE AND KITS USED IN THE SAME

Patent code P210017420
File No. AF19-11JP2
Posted date Jan 29, 2021
Application number P2019-082608
Publication number P2019-144264A
Date of filing Apr 24, 2019
Date of publication of application Aug 29, 2019
Priority data
  • P2014-192311 (Sep 22, 2014) JP
Inventor
  • (In Japanese)野地 博行
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人科学技術振興機構
Title DETECTION METHOD OF TARGET MOLECULE AND KITS USED IN THE SAME
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a detection method of a target molecule.
SOLUTION: The detection method includes: a complex forming step of reacting a target molecule 1 and a carrier 2 in which a first antibody 3 specifically bonding with the target molecule is modified with second antibodies 41, 42 which specifically bond with the target molecule, are labeled with enzymes having substrate cleavage activity and have different substrate specificities of enzymes from each other so as to form a complex comprising the first antibody, the target molecule and the second antibodies on the carrier; and a step of detecting a fluorescence emitted from fluorescent substances by reacting the complex with two or more substrates which have cleavage sites 71, 72 of enzymes, have fluorescent materials 81, 82 bonded on one end of the cleavage sites and have decoloring materials 91, 92 bonded on the other end thereof, and have different fluorescence wavelengths of the fluorescent substances from each other.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)

種々の疾患の早期診断を目的として、生体サンプル中に低濃度に存在する疾病マーカー(バイオマーカー)を高感度に検出するためのバイオセンシング技術が求められている。例えば、体積1mm3の腫瘍に含まれる100万個の癌細胞のそれぞれからバイオマーカー100分子が5Lの血中に分泌された場合、バイオマーカーの血中濃度は30aM程度となる。このような非常に低濃度のターゲット分子を検出可能な技術が求められている。

非特許文献1には、一分子の酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)を用いてタンパク質を検出する方法が記載されている。この方法では、タンパク質特異的な抗体で覆われた微細なビーズによって微量のタンパク質を捕捉し、ビーズとタンパク質との複合体を蛍光標識させる。この複合体を含むビーズを遠心力によって反応チャンバーに導入し、タンパク質を捕捉しているビーズの数を数えることによって、タンパク質を定量的に測定する。

特許文献1には、「一分子デジタル計数デバイス」として、超高密度に微小な液滴を形成可能なアレイデバイスが開示されている。ELISAを微小な体積の液滴中で行うことで、ターゲット分子からのシグナルを2値化して測定を行うことができる(デジタルELISA法)。具体的には、まず、ターゲット分子、捕捉抗体を表面修飾したビーズ、及び検出抗体を反応させ、ビーズ表面上に「捕捉抗体-ターゲット分子-検出抗体」の複合体を形成させる。ターゲット分子の濃度が低い場合、個々のビーズは、複合体を1分子のみ結合しているか、全く結合していないかのどちらかになる。次に、アレイデバイスに形成した多数の微小液滴のそれぞれにビーズを1つずつ封入する。そして、検出抗体に由来するシグナルを発する液滴の数をターゲット分子の数としてカウントする。これにより、ターゲット分子からのシグナルを0か1に2値化して、ターゲット分子の検出及び定量を高感度かつ高精度に行うことができる。

本発明に関連して、特許文献2には、酵素免疫検査法において、目的物質と反応する抗体の標識として制限酵素を用い、制限酵素の切断塩基配列を有するDNA鎖を複合体の制限酵素により切断し、該切断されたDNA鎖断片を分析して測定することにより目的物質を検出する方法が開示されている。

Field of industrial application (In Japanese)

本発明は、ターゲット分子の検出方法及びこれに用いられるキットに関する。より詳しくは、ターゲット分子を、担体上における該ターゲット分子と抗体との抗原抗体反応に基づいて検出する方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
ターゲット分子と、
前記ターゲット分子に特異的に結合する第一の抗体が修飾された粒子と、
前記ターゲット分子に特異的に結合し、互いに異なる標識がされた二以上の第二の抗体と、
を反応させて、前記粒子上に前記第一の抗体と前記ターゲット分子と前記第二の抗体とからなる複合体を形成させる複合体形成手順と、
前記標識からの信号を検出する検出手順と、
異なる二以上の前記標識からの前記信号を前記ターゲット分子の検出信号として処理する解析手順と、を含むターゲット分子の検出方法。

【請求項2】
 
前記複合体形成手順と前記検出手順との間に、基板上に形成された液滴のそれぞれに前記粒子を一つずつ封入する封入手順を含む、請求項1記載の検出方法。

【請求項3】
 
前記第一の抗体と前記第二の抗体が前記ターゲット分子の異なるエピトープに結合する、請求項1又は2記載の検出方法。

【請求項4】
 
デジタルELISA法である、請求項1-3のいずれか一項に記載の検出方法。
IPC(International Patent Classification)
Drawing

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JP2019082608thum.jpg
State of application right Published
Reference ( R and D project ) CREST Creation of Nanosystems with Novel Functions through Process Integration AREA
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