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未分化細胞検出法

国内特許コード P210017862
整理番号 (S2018-0734-N0)
掲載日 2021年8月23日
出願番号 特願2020-525673
出願日 令和元年6月14日(2019.6.14)
国際出願番号 JP2019023599
国際公開番号 WO2019240247
国際出願日 令和元年6月14日(2019.6.14)
国際公開日 令和元年12月19日(2019.12.19)
優先権データ
  • 特願2018-115025 (2018.6.15) JP
発明者
  • 谷口 英樹
  • 関根 圭輔
出願人
  • 公立大学法人横浜市立大学
発明の名称 未分化細胞検出法
発明の概要 分化細胞集団中の未分化細胞の残存/混入を検出可能なマーカー遺伝子を提供する。ESRG、VSNL1、THY1、SFRP2、SPP1、USP44及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子を未分化マーカーとして使用することにより、分化細胞集団中に存在する未分化細胞を検出する。未分化細胞を検出する方法、未分化マーカーとしての使用方法、未分化細胞検出キット。未分化細胞株の選別方法も提供される。
従来技術、競合技術の概要

再生医療に用いる分化細胞集団中における未分化iPS細胞の残存/混入を検出、評価することは癌化リスクの観点から極めて重要である。これまでに、未分化iPS細胞の残存/混入を検出、評価する手法は定量PCR(qPCR)によるiPS細胞特異的遺伝子の検出法(非特許文献1)、分化細胞を未分化細胞の培養維持条件で再培養することによる方法(非特許文献2)が報告されている。

従来技術の中で、再培養法は、混入する未分化iPS細胞からコロニーを形成させるため正確性が高いという利点が有る一方、検出までに1週間以上かかることから、定量PCRを用いた方法が簡便・迅速に実施可能な点で優れている。

しかしながら、これまでに報告のあるLIN28(非特許文献1)は発現の低い臓器/組織の分化細胞(網膜色素上皮細胞)が有る一方で、肝細胞などの分化細胞やiPS細胞から分化誘導した細胞では発現が見られることから、様々な分化細胞を対象にした未分化iPS細胞の残存/混入の検出には利用できないという課題が有った。

産業上の利用分野

本発明は、未分化細胞検出法に関する。

特許請求の範囲 【請求項1】
分化細胞集団における、ESRG、VSNL1、THY1、SFRP2、SPP1、USP44及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベル及び/又はプロモーター活性を測定することを含む、未分化細胞を検出する方法。

【請求項2】
未分化細胞が、胚性腫瘍細胞(EC細胞)、胚性幹細胞(ES細胞)、人工多能性幹細胞(iPS細胞)又は胚性生殖細胞(EG細胞)であり、分化細胞集団が前記未分化細胞から分化した細胞の集団である請求項1記載の方法。

【請求項3】
分化細胞集団が、内胚葉、中胚葉又は外胚葉のいずれかの分化細胞の集団である請求項1又は2に記載の方法。

【請求項4】
内胚葉の分化細胞が、肝内胚葉細胞である請求項3記載の方法。

【請求項5】
中胚葉の分化細胞が、横中隔間充織細胞、間葉系細胞又は血管内皮細胞である請求項3記載の方法。

【請求項6】
外胚葉の分化細胞が、神経幹細胞、神経堤細胞又は神経細胞である請求項3記載の方法。

【請求項7】
遺伝子の発現レベルをmRNAの量又はタンパク質の量として測定する請求項1~6のいずれかに記載の方法。

【請求項8】
遺伝子の発現レベルをqPCR、デジタルPCR、免疫染色、in situ hybridization、RNAシークエンス、マイクロアレイ、NanoString、抗体アレイ、FlowCytometry又は質量分析で測定する請求項1~7のいずれかに記載の方法。

【請求項9】
未分化細胞株から分化誘導された内胚葉、中胚葉又は外胚葉のいずれかの分化細胞における、ESRG、VSNL1、THY1、SFRP2、SPP1、USP44及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベル及び/又はプロモーター活性を測定することによって、安全性の高い未分化細胞株を選別する方法。

【請求項10】
未分化細胞株が、胚性腫瘍細胞(EC細胞)株、胚性幹細胞(ES細胞)株、人工多能性幹細胞(iPS細胞)株又は胚性生殖細胞(EG細胞)株である請求項9記載の方法。

【請求項11】
未分化細胞株がiPS細胞株である請求項10記載の方法。

【請求項12】
分化細胞をモデル動物へ移植して形成された組織における、ESRG、VSNL1、THY1、SFRP2、SPP1、USP44及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現レベル及び/又はプロモーター活性を測定することを含む、未分化細胞を検出する方法。

【請求項13】
分化細胞集団中に存在する未分化細胞を検出するために、ESRG、VSNL1、THY1、SFRP2、SPP1、USP44及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子を未分化マーカーとして使用する方法。

【請求項14】
ESRG、VSNL1、THY1、SFRP2、SPP1、USP44及びCNMDよりなる群より選択される少なくとも1つの遺伝子の発現を検出可能な試薬及び/又はプロモーター活性を測定可能な試薬を含む、未分化細胞を検出するためのキット。

【請求項15】
遺伝子の発現を検出可能な試薬が、プライマー、プローブ又は抗体である請求項14記載のキット。

【請求項16】
遺伝子のプロモーター活性を測定可能な試薬が、プロモーター下流にレポータータンパク質を連結した遺伝子配列又はこの遺伝子配列を組み込んだベクターである請求項14記載のキット。
国際特許分類(IPC)
Fターム
画像

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JP2020525673thum.jpg
出願権利状態 公開
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