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DOUBLE LABELING DETECTION METHOD COMPRISING COMBINATION OF CHEMOLUMINESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION AND IMMUNOHISTOCHEMICAL DYEING commons

Patent code P03A001158
Posted date Apr 16, 2004
Application number P1999-121519
Publication number P2000-310637A
Patent number P3127244
Date of filing Apr 28, 1999
Date of publication of application Nov 7, 2000
Date of registration Nov 10, 2000
Inventor
  • (In Japanese)納 光弘
Applicant
  • (In Japanese)国立大学法人鹿児島大学
Title DOUBLE LABELING DETECTION METHOD COMPRISING COMBINATION OF CHEMOLUMINESCENCE IN SITU HYBRIDIZATION AND IMMUNOHISTOCHEMICAL DYEING commons
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for performing a double labeling detection method due to chemoluminescence in situ hybridization and immunohistochemical dyeing with respect to the same specimen and a detection apparatus for performing detection with high sensitivity and high resolution.
SOLUTION: In a double labeling detection method for detecting tissue or a cell having a specific nucleic acid and a second cell related substance other than a nucleic acid by combining chemoluminescence in situ hydridization and immunohistochemical dyeing, a process for performing chemoluminescence in situ hybridization with respect to tissue slices or cells in a specimen by using a probe for a target intracellular nucleic acid, a process for obtaining the emission image of the specimen, a process for storing a position generating luminescence in the specimen, a process for performing immunohistochemical dyeing by using an antibody to the second cell related substance and a process for obtaining the transmitted light image of the specimen to which immunohistochemical dyeing is applied at the stored position are provided.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


細胞内において発現された物質の検出、並びに細胞の表現型の同定は、種々の疾患の病態機序を解明するための重要な手段である。
核酸、タンパク等の細胞内において発現される物質を検出する手段として、mRNAをin situで検出する方法が広汎に使用されている。mRNAは、標識化プローブによるin situハイブリダイゼーション(in situ hybridization)で一般的に検出される。近年では、このようなmRNAの検出に、化学発光を指標として用いる試みが行われているが、化学発光物質を標識として用いたin situハイブリダイゼーション法には測定感度に限界がある。
一方、科学の進歩により、微量な疾患関連因子やこれを発現する少数細胞を検出する必要が生じてきた。例えば、ヒトT細胞白血病ウイルスI型関連脊髄症(human T-lymphotropic virus type I-associated myelopathy:HAM)の発症には、HTLV-I(human T-lymphotropic virus)の感染が深く関与している(納光弘,HTLV-1-associated Myelopathy(HAM), medicina,1988 25(10):2216-2217)。しかしながら、HAMを発症する患者の末梢血においてHTLV-Itax遺伝子(HTLV-I に特異的な mRNA の配列の一部分)を発現する細胞は非常に少なく、また、HTLV-Iの発現量自体も非常に少ないため、従来の方法を用いての研究は非常に困難なものであった。その理由は、第1に、生体から得た標本中に目的とする感染細胞を発見することが難しいことである。第2に、仮に発見し得た場合でも、この同定された細胞自体に対して免疫組織化学的染色等の第2の異なる検出法を適用できない限り、発見した感染細胞の細胞表現型を決定することさえも困難なことである。更に、発現するmRNA量が少ないため、測定は高感度に行える方法に、現実的には化学発光in situハイブリダイゼーション法に限られてしまう。従って、同一の細胞に対して化学発光in situハイブリダイゼーション法と免疫染色法等の検出方法を合わせて実施することが可能であり、且つ該検出の感度が非常に優れた検出手段の開発が要望されていた。

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、化学発光in situハイブリダイゼーション(chemiluminescent in situ hybridization)と発色による免疫組織化学的染色(immunohistochemistry)とを組合わせた二重標識検出方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
ヒトT細胞白血病ウイルスI型に感染した患者より得た標本中でHTLV-Itax遺伝子を発現している細胞を検出し、該細胞についてその細胞表現型を決定する方法であって、
(1)標本中の組織切片又は細胞に、前記遺伝子に対するプローブを用いて化学発光in situハイブリダイゼーションを行なう工程と、
(2)前記標本の透過光画像を得た後に発光画像を得る工程と、
(3)該標本において発光を生じている位置を記憶する工程と、
(4)次に、細胞関連物質に対する抗体を用いて、免疫組織化学的染色を行なう工程と、および
(5)前記記憶した位置において、前記免疫組織化学染色を施した標本の透過光画像を得る工程と、
を具備する方法。

【請求項2】
 
請求項1に記載の方法であって、前記(2)から(5)の工程を以下の要素;
(1)目的とする標本上の全ての位置について画像を得ることができ、且つ検出位置の記憶及び記憶された検出位置の再現を行なうことができるXYステージを備えた落射蛍光顕微鏡と;
(2)前記2台のCCDカメラと;
(3)前記カメラに接続したデータ解析装置と;および
(4)前記データ解析装置に接続したモニタ解析装置と、
を具備する装置を用いることにより行なうことを特徴とする方法。

【請求項3】
 
請求項1または2の何れか1項に記載の方法であって、前記組織切片又は細胞がスライドグラスに具備されるチャンバー内に固定されることによって標本とされ、前記発光画像を得る工程における該標本には、ポリビニルアルコールを含有する染色液が具備されることを特徴とする方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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05221_03SUM.gif
State of application right Registered
(In Japanese)公開特許は弊社ホームページ内で開示資料とともに、特許公報も掲載しております。
アドレスは http://www.ktlo.co.jp/002_seeds_.html


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