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METHOD FOR POINT MUTATION OF BASE USING PHOTOCOUPLING NUCLEOSIDE-CONTAINING DNA achieved

Patent code P03A001968
File No. A051P187
Posted date Oct 1, 2003
Application number P2000-382283
Publication number P2002-179696A
Patent number P3753938
Date of filing Dec 15, 2000
Date of publication of application Jun 26, 2002
Date of registration Dec 22, 2005
Inventor
  • (In Japanese)齋藤 烈
  • (In Japanese)藤本 健造
  • (In Japanese)松田 成夫
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人科学技術振興機構
Title METHOD FOR POINT MUTATION OF BASE USING PHOTOCOUPLING NUCLEOSIDE-CONTAINING DNA achieved
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a simple, sure and specific nonpollution method for point mutation at a low cost, and a new method for genetic manipulation by which practical use can be carried out.
SOLUTION: The method for the point mutation of a specific base in nucleic acids comprises irradiating the nucleic acids having a base to be converted such as DNA, RNA or a peptide nucleic acid(PNA) with light in the presence of a DNA containing a photocoupling nucleoside, coupling the base to be converted to the photocoupling nucleoside, chemically modifying the base to be converted, then irradiating the resultant chemically modified base with light and cleaving the resultant substance into the base to be converted and the photocoupling nucleoside. Furthermore, the method is to produce the nucleic acids subjected to the point mutation by the method.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


DNAやPNA(ペプチド核酸)などの核酸類中の特定の位置の塩基を他の塩基に変換する方法は、点変異(ポイントミューテーション)として変異した核酸類を調製したり、核酸類の機能解析のための技術として重要視されてきている。
しかし、従来の点変異の技術は酵素反応を用いるために特異性や確実性の点において充分ではなく、その効率も必ずしも充分ではなかった。また、酵素反応を用いた方法では、後処理の必要な化学活性化剤を使用しなければならず、コストがかかり、かつ反応条件の至適化や制御が難しく、実用化が困難であった。
また、任意の位置のシトシンのみをウラシルへと点変異させることは従来はできなかった。シトシンからウラシルへの変換は、任意の位置ではないが、同じ鎖内でピリミジンダイマー生成、デアミネーション、及びフォトリアーゼによる光解裂によりシトシンをウラシルへと変異させた例があるが、この方法では酵素を用いる点、他のサイトとの競争反応がある点、及び効率が低い点等において改良の余地があった。



一方、本発明者らは、先に光化学反応により光連結性ヌクレオシドを含有するDNAと、炭素-炭素二重結合を有する塩基を有する核酸類(DNAやPNAなど)を光化学反応により連結と開裂を特異的に行うことができることを見出してきた(特願2000-67519号参照)。

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、DNA、RNA、PNAなどの核酸類中の特定の位置の塩基を、他の塩基に点変異させる方法、及びその方法により点変異した核酸類を製造する方法に関する。より詳細には、本発明は、核酸類中の特定の位置の塩基を、光連結性ヌクレオシドを含有するDNAの存在下で、光化学反応を利用して酵素の不存在下で他の塩基に変換することからなる核酸類中の特定の位置の塩基を点変異させる方法、及びその方法により点変異した核酸類を製造する方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
変換したい塩基としてシトシンを有する核酸類を、
次式I:
【化1】
 


(式中、ZはO又はNHを示し、X及びYの少なくとも一方は電子吸引性基を示し、X及びYの残りの基は水素原子を示す。)
で表される基を有する光連結性ヌクレオシドを末端に含有するDNAの存在下で、光照射して変換したい塩基と前記光連結性ヌクレオシドとを結合させ、変換したい塩基を化学的に変性させた後、光照射して変換したい塩基と光連結性ヌクレオシドとを開裂させることからなる、核酸類中の塩基が点変異した核酸類を製造する方法。

【請求項2】
 
電子吸引性基が、カルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基又はシアノ基である請求項1に記載の方法。

【請求項3】
 
ZがOで、Xが水素原子で、Yがカルボキシル基、低級アルコキシカルボニル基、置換アミド基又はシアノ基である請求項1又は請求項2に記載の方法。

【請求項4】
 
化学的に変性させる方法が、脱アミノ化である請求項1~3のいずれかに記載の方法。

【請求項5】
 
核酸類の一部を固定化させるためのテンプレートを用いる請求項1~4のいずれかに記載の方法。

【請求項6】
 
核酸類が、DNA、RNA、又はPNAである請求項1~5のいずれかに記載の方法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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State of application right Registered
Reference ( R and D project ) CREST Single Molecule and Atom Level Reactions AREA
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