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METHOD FOR PRODUCING CHIB 2-TYPE CHITINASE

Patent code P04A004772
Posted date Nov 29, 2004
Application number P1999-298255
Publication number P2001-112469A
Patent number P3108767
Date of filing Oct 20, 1999
Date of publication of application Apr 24, 2001
Date of registration Sep 14, 2000
Inventor
  • (In Japanese)荒平 正緒美
  • (In Japanese)深澤 親房
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
Title METHOD FOR PRODUCING CHIB 2-TYPE CHITINASE
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for efficiently isolating/purifying in a short time with a simple column operation chib 2-type chitinase as a new class belonging to PR-8 chitinase family from soybeans as raw material.
SOLUTION: This method comprises the following steps: defatted soybean flour is subjected to extraction with deionized water or an acetate buffer solution, a protein fraction is separated from the resultant extract solution and then put to dialysis treatment followed by hydrophobic chromatography, a fraction having chitinase activity is then separated from the resultant eluate and subsequently subjected to hydrophobic chromatography again. The other version of this method comprises the following practice: the purified chib 2-type chitinase obtained above is passed through a column with mannose-bindable lectin bound to an insoluble support to effect separation into sugar chain-bearing and sugar chain-free modifications of the further purified chib 2-type chitinase.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)



キチナーゼ〔EC 3.2.1.14〕は、N-アセチル-D-グルコサミンのポリマーであるキチンのβ-1,4結合に作用する加水分解酵素である。キチナーゼは、4つのファミリーに分類され、このうちのクラスI(chia1型)、クラスII(chia2型)およびクラスIV(chia4型)は共通の性質を有し、PR-3キチナーゼファミリーに属している。一方、クラスIIIは上記3クラスの酵素とは異なる性質を示し、PR-8キチナーゼファミリーに属する。

従来、クラスIIIには、植物においてchib1型キチナーゼの存在のみが確認されていたが、本発明者らの研究の結果、ダイズにおいて、chib2型のキチナーゼの存在が確認された(Yeboah, N. A., Arahira, M., Nong, V. H., Zhang, D., Kadokura, K., Watanabe, A. and Fukazawa, C. (1998) A class III acidic endochitinase is specifically expressed in the developing seeds of soybean (Glycine max [L.] Merr.) Plant Molecular Biology, 36, 407-415) 。

chib2型のキチナーゼは、chib1型キチナーゼと相同性が高いことから、同じクラスIIIのPR-8キチナーゼファミリーに分類されている。構造的には、C末端部分の配列が明らかに長いことにおいて、chib1型キチナーゼと相違している。また、この酵素には糖鎖を有しているものと有していないものとがある。chib2型のキチナーゼは、種子の成長初期から終期までの長期間にわたり分泌されており、ダイズの成長期の防御のみならず、休眠期の防御にも深く関係していることが分かっている。

chib2型のキチナーゼは、前記したように、本発明者らによって初めて見出されたものである。ダイズから該酵素を分離、精製するための操作は、上記文献に記載されているように、極めて複雑で長時間を要する上に、酵素の収率が低く、実用性に欠けるものである。

Field of industrial application (In Japanese)



本発明は、ダイズ種子や脱脂ダイズ粉などからPR-8キチナーゼファミリーに属するchib2型のキチナーゼを簡便に、且つ大量に製造する方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
脱脂大豆粉を脱イオン水又は酢酸緩衝液で抽出し、得られた抽出液からタンパク質画分を分離した後、該タンパク質画分を透析処理し、次いで疎水性クロマトグラフィーを行い、得られた溶出液からキチナーゼ活性を有する画分を分離し、再度疎水性クロマトグラフィーを行うことを特徴とする精製chib2型キチナーゼの製造法。

【請求項2】
 
請求項1記載の方法によって得られた精製chib2型キチナーゼを、マンノース結合性レクチンを不溶性担体に結合させたカラムに通すことにより、糖鎖のあるものとないものとに分離することを特徴とする精製chib2型キチナーゼの製造法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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08319_01SUM.gif
State of application right Registered


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