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MODIFIED DEXTRANSUCRASE, GENE RECOMBINANT THEREOF AND METHOD FOR PRODUCING GLUCAN

Patent code P04A004805
Posted date Nov 29, 2004
Application number P2001-307067
Publication number P2003-111590A
Patent number P3709435
Date of filing Oct 3, 2001
Date of publication of application Apr 15, 2003
Date of registration Aug 19, 2005
Inventor
  • (In Japanese)舟根 和美
  • (In Japanese)小林 幹彦
  • (In Japanese)北村 義明
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
Title MODIFIED DEXTRANSUCRASE, GENE RECOMBINANT THEREOF AND METHOD FOR PRODUCING GLUCAN
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To develop a modified enzyme by searching an active center site of an enzyme that has conventionally been not noticed on a dextransucrase and a glucosyltransferase and by exchanging the sites between different enzymes, and to provide a method for producing a glucan having a largely changed structure by using the enzymes.
SOLUTION: Disclosed are a modified dextransucrase comprising exchanging a part of the active center region of the dextransucrase for an active center region of a different kind of dextransucrase, a vector transduced by a gene encoding the modified dextransucrase and a gene recombinant transformed by the vector, and a method for producing the glucan featured by acting the modified dextransucrase on a substrate.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)



グルカンは、デンプンやセルロース等のD-グルコースを構成単位とする多糖(デキストラン等)の総称であり、微生物や植物の細胞壁の主要構成成分として知られているものもある。

様々な構造を有するグルカンを生産するために、これまでは異なった構造のグルカンを生産する菌をスクリーニングし、それらの菌株を培養してグルカンの発酵生産を行う方法が採用されている。

また、ロイコノストック(Leuconostoc)属菌のデキストラン生産性向上を目的としてニトロソグアニン等を用いた変異処理も試みられている。さらには、ロイコノストック属菌やストレプトコッカス(Streptococcus)属菌によって産生されるデキストランスクラーゼ[EC 2.4.1.5](以下、DSと略記することがある。)あるいはグルコシルトランスフェラーゼ[EC 2.4.1.125](以下、GTFと略記することがある。)をコードする遺伝子を大腸菌に導入して、該酵素を生産させ、この酵素を用いてデキストランを生産することは研究室レベルで行われている。





DSは、前記の微生物等により生産される分子量16万前後の酵素で、基質であるスクロースを分解する反応を触媒し、フルクトースを遊離すると同時にグルコース部分を多糖またはオリゴ糖に転移して、α-1→6結合を主体とする高分子の水溶性α-D-グルカンであるデキストランを合成する酵素である。

また、ロイコノストック属菌由来のグルカン合成酵素には、水溶性のグルカンを合成する酵素の他に、α-1→3結合を主体とする非水溶性のグルカンを合成する酵素が存在し、いずれもGTFと呼ばれている。複数のGTFの作用で、固着性の強いムタンと呼ばれるグルカンを形成する。

本来のデキストランとは異なる構造を有するデキストランを得るには、これまでは目的の構造を有するデキストランを生産する菌株を、スクリーニングにより探し出すこと以外には有効な方法がなく、膨大な時間と労力を必要としていた。





DSやGTFによって生産されるグルカンの構造を変化させるために、これらの酵素をコードする遺伝子に、3’-末端のグルカン結合領域のデレーション処理を行い、該結合領域を異なる酵素同士で交換する、部位特異的変異法を用いて特定のアミノ酸残基を別のアミノ酸に置き換える等の処理を行い、変異酵素を作製することが行われている。

ここで、グルカン結合領域とは、カルボキシ末端の繰り返し構造を持った領域を言い、これをデレーション処理することによって、カルボキシ末端が短くなった酵素が生産されるのである。





しかし、上記した3’-末端のグルカン結合領域のデレーション処理や異なる酵素間での同領域の交換等の従来の方法では、生産するグルカンの構造をほとんど変えることはできなかった。これは、グルカン結合領域の役割が、単純にグルカンと結合するのみで、酵素反応自体には関与していないことが明らかとなったことからも裏付けられている。

また、部位特異的変異法では、生産するグルカンの構造をある程度変えることが可能であるが、構造を大きく変化させることは未だ成功していない。そのため、酵素の転移反応様式を決める部位が特定されておらず、生産物の構造制御を行うことは困難である。

Field of industrial application (In Japanese)



本発明は、改変デキストランスクラーゼ、その遺伝子組み換え体およびグルカンの製造法に関し、詳しくはロイコノストック・メセンテロイデスのデキストランスクラーゼの活性中心領域の一部を、同菌の異種のデキストランスクラーゼの活性中心領域と交換してなる改変デキストランスクラーゼ、その遺伝子組み換え体およびグルカンの製造法に関する。

本発明の改変デキストランスクラーゼを用いて製造されるグルカンは、α-1,3結合、α-1,4結合およびα-1,6結合の割合が、本来のものとは異なるという特性を有している。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
ロイコノストック・メセンテロイデスのデキストランスクラーゼのスクロース・デキストラン結合リシン部位を、同菌の異種のデキストランスクラーゼのスクロース・デキストラン結合リシン部位と交換してなる改変デキストランスクラーゼ。

【請求項2】
 
ロイコノストック・メセンテロイデスのデキストランスクラーゼのムタン結合部位を、同菌の異種のデキストランスクラーゼのムタン結合部位と交換してなる改変デキストランスクラーゼ。

【請求項3】
 
ロイコノストック・メセンテロイデスのデキストランスクラーゼのデキストラン結合リシン部位を、同菌の異種のデキストランスクラーゼのデキストラン結合リシン部位と交換してなる改変デキストランスクラーゼ。

【請求項4】
 
請求項1~3のいずれかの改変デキストランスクラーゼをコードする遺伝子を挿入したベクター。

【請求項5】
 
請求項4のベクターで形質転換された遺伝子組み換え体。

【請求項6】
 
請求項1~3のいずれかの改変デキストランスクラーゼを基質に作用させることを特徴とするグルカンの製造法。

【請求項7】
 
請求項5記載の遺伝子組み換え体が生産する改変デキストランスクラーゼを基質に作用させることを特徴とするグルカンの製造法。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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13331_01SUM.gif
State of application right Registered


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