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CRYOPROTECTANT AND ITS UTILIZATION meetings achieved

Patent code P04A005906
File No. KANDAI-12
Posted date Feb 1, 2005
Application number P2000-059444
Publication number P2001-139599A
Patent number P4334719
Date of filing Mar 3, 2000
Date of publication of application May 22, 2001
Date of registration Jul 3, 2009
Priority data
  • P1999-240928 (Aug 27, 1999) JP
Inventor
  • (In Japanese)小幡 斉
  • (In Japanese)河原 秀久
  • (In Japanese)山出 和弘
  • (In Japanese)小村 啓悟
  • (In Japanese)金子 昌二
  • (In Japanese)坂本 紀子
Applicant
  • (In Japanese)学校法人 関西大学
Title CRYOPROTECTANT AND ITS UTILIZATION meetings achieved
Abstract

PROBLEM TO BE SOLVED: To obtain a cryoprotectant derived from a microorganism, capable of preventing frozen denaturation of a protein such as a metabolic enzyme by addition of relatively low concentration and provide a method for producing the substance and utilization invention of the substance.

SOLUTION: This cryoprotectant is produced by a microorganism belonging to the genus Erwinia or the genus Xanthomonas. This method for producing the cryoprotectant comprises inducing expression of cryoprotectant by culturing the microorganism at ≤30°C and obtaining the cryoprotectant from the cultured product. A method for stabilization/storage of a protein and a biological material comprises using the above cryoprotectant.

Outline of related art and contending technology (In Japanese)
タンパク質や細胞、微生物、あるいは動物臓器等を長期間にわたって保存するためには、これらを凍結する手段が採られている。しかしながら、一般に、タンパク質を凍結させるとその高次構造が変化すること(以下、この変化を「凍結変性」と記載する)が知られており、凍結変性が起こるとそのタンパク質は失活し、融解後に本来の機能を回復できない。
【0003】
従来、このようなタンパク質の凍結変性を防止する方策としては、グルコース、ショ糖、トレハロース、ソルビトールなどの糖類や、グリセリンや、アルブミンなどを添加することが知られており、これらを添加することにより、凍結時にタンパク質の凍結変性を防止し、融解後にそのタンパク質の本来の機能を回復させることができる。このため、これらの物質の溶液は、例えば、血液、臓器、酵素などの保存液として用いられている。
Field of industrial application (In Japanese)
この出願の発明は、代謝系酵素などのタンパク質の凍結変性を防止することができる凍結保護物質の調製方法に関するものである。
Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
  パントエア・アグロメランス(Pantoea agglomerans)を、20~40℃で前培養した後、5℃~18℃、10~96時間低温培養し、低温培養後の菌体内の物質を、硫酸アンモニウムで塩析し、硫酸アンモニウムでの塩析後の画分を、第4級アンモニウム基を有する陰イオン交換クロマトグラフィーにかけて活性画分を溶出させ、溶出された活性画分を吸着クロマトグラフィーにかけてさらに活性画分を溶出させ、溶出された活性画分をゲルろ過クロマトグラフィーにかけてさらに活性画分を溶出させ、溶出された活性画分を疎水性クロマトグラフィーにかけてさらに活性画分を溶出させ、溶出された活性画分を分取して、分子量29000Da(ゲル濾過クロマトグラフィーによる測定、及びSDS-ポリアクリルアミドゲル電気泳動による測定)の単量体からなる凍結保護物質を精製することにより得られる凍結保護物質を、0.01~1μg/mlの濃度に調製することを特徴とする凍結保護物質の調製方法。
【請求項2】
  析を、飽和度60~80%の硫酸アンモニウムによって行う請求項1記載の凍結保護物質の調製方法。
【請求項3】
  イオン交換クロマトグラフィーによる精製工程において、リン酸カリウム緩衝液と塩化ナトリウムにより、塩化ナトリウムの濃度勾配溶出法で活性画分を溶出させる請求項1又は2記載の凍結保護物質の調製方法。
【請求項4】
  着クロマトグラフィーによる精製工程において、リン酸カリウム緩衝液の濃度勾配溶出法で活性画分を溶出させる請求項1乃至3のいずれかに記載の凍結保護物質の調製方法。
【請求項5】
  ルろ過クロマトグラフィーによる精製工程において、塩化ナトリウムを含むリン酸カリウム緩衝液で溶出させる請求項1乃至4のいずれかに記載の凍結保護物質の調製方法。
【請求項6】
  水性クロマトグラフィーによる精製工程において、リン酸カリウム緩衝液と硫酸アンモニウムにより、硫酸アンモニウムの濃度勾配溶出法で活性画分を溶出させる請求項1乃至5のいずれかに記載の凍結保護物質の調製方法。
Industrial division
  • Organic compound
  • Microbial industry
IPC(International Patent Classification)
Drawing

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24099_01SUM.gif
State of application right Right is in force
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