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NOVEL PEPTIDE WHICH SPECIFICALLY ACTS ON BIOLOGICAL MEMBRANE

Patent code P04A005944
File No. 化学・薬品-116
Posted date Feb 16, 2005
Application number P2003-303747
Publication number P2004-248666A
Patent number P4366497
Date of filing Aug 27, 2003
Date of publication of application Sep 9, 2004
Date of registration Sep 4, 2009
Priority data
  • P2002-253169 (Aug 30, 2002) JP
  • P2003-021198 (Jan 29, 2003) JP
Inventor
  • (In Japanese)町田 幸子
  • (In Japanese)温 浙盛
  • (In Japanese)徳安 健
  • (In Japanese)松永 茂
  • (In Japanese)小堀 真珠子
  • (In Japanese)榊原 祥清
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
Title NOVEL PEPTIDE WHICH SPECIFICALLY ACTS ON BIOLOGICAL MEMBRANE
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for screening for a peptide specifically acting on biological membranes, and to provide the peptide specifically acting on the cell membrane of microorganisms by the screening method.
SOLUTION: The method for screening nucleic acid encoding the peptide acting on the biological membrane comprises a step of designing and constructing a DNA library: a step of forming a peptide/ribosome/mRNA complex by transferring and translating the library in a cell-free system: and a step of selecting the complex which specifically links to the membrane model.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


天然には、生体膜に作用して膜に穴をあける能力(ポア形成能)を有するペプチドが存在する。このペプチドは、膜作動性ペプチドと呼ばれ、植物、昆虫、無脊椎動物からヒトを含む脊椎動物にわたって広く存在し、微生物を含む広範な生物の生体膜を認識し、そして特異的に作用することが知られている。特に、微生物の生体膜に作用する膜作動性ペプチドは、生体膜のバリアー能を損傷させることによって微生物を殺傷する能力を有する。このようなペプチドとして単離されたものは、例えば、Michael Zasloff,Nature 415:389-395(2002)、および松崎勝巳著「抗菌性生体防御ペプチド:作用機構とその応用」FFI JOURNAL,No.190:23-27(2001)に総説され、また、例えば、特開2001-288105公報、特開2001-186887公報、特開2001-2582公報、特開2000-63400公報、特表2002-503701公報、特表2002-503641公報、特表2001-527412公報、特表2001-517422公報、および特表平9-512711公報などに開示される。微生物に対する膜作動性ペプチドとしては、ミツバチ毒由来のメリチン、スズメバチ毒由来のマストパランXおよびアフリカツメガエル由来のマガイニン2が挙げられる。メリチンおよびマストパランXは、微生物細胞膜に作用すると同時に溶血性も示すが、マガイニン2は、溶血性を示さず、微生物細胞膜に特異的なポア形成能を有する。また、マストパランXの基本骨格を改変したペプチドであるマスト21(mast21)は、微生物細胞膜に対して特異的ポア形成能を有しかつ溶血性を欠失している(特許第2967925号明細書を参照のこと)。このように、溶血性を示さず、かつ微生物細胞膜に対して特異的なポア形成能を有するペプチドは、生体防御ペプチドと呼ばれる。本発明の生体防御ペプチドは、食品または工業製品の腐敗を生じさせる微生物を殺傷するための抗菌ペプチド、あるいは動物および/または植物に感染する微生物に対する抗菌ペプチドして機能する。さらに、本発明のペプチドは、耐性菌を産生させる可能性の低い抗生物質として利用し得る。



生体防御ペプチドは、微生物細胞膜を特異的標的とすることから、微生物などの異物が体内に侵入した場合に、これら異物に対して所望の薬剤を送達する機構である、ドラッグデリバリーシステムのシグナルとして利用し得る。従って、本発明のペプチドは、例えば、薬物を体内の必要な場所にのみ必要な量だけを作用させて、その効果を最大限に発揮させるドラッグデリバリーシステムにおけるシグナルとしての利用といった広範な種々の応用が期待されている。



微生物の生体膜と動物細胞の生体膜との間には、含有されるリン脂質に基づく構造上の差異が存在する。微生物細胞膜表面にはフォスファチジルグリセロール、フォスファチジルセリン、カルジオリピンなどの酸性リン脂質が存在するのに対して、健康な動物細胞膜表面には酸性リン脂質は露出しておらず、逆に微生物細胞膜には存在しないコレステロールが豊富に存在している。生体防御ペプチドは、このような膜の構造上の差異を認識して膜にポアを形成すると考えられている。しかし、既知の生体防御ペプチドが有する抗菌性は、全ての細菌、真菌などに対して示されるものではなく、ペプチド毎に様々な抗菌スペクトルを示す。その上、安定性に欠けるといった問題点も指摘され、生体防御ペプチドを抗菌ペプチドとして利用するには至っていない。目的に応じたペプチドを得るために、配列が既知であるペプチドを改変し、目的に応じた活性を増強したペプチドを作出するなどの試みが行われている(例えば、Sachiko Machidaら、Biosci.Biotechnol.Biochem.,64:985-994(2000)、およびSong Yub Shinら、Biochemical Biophysical Research Communications,275:904-909(2000)を参照のこと)。しかし、ランダムなライブラリーから細胞膜構造を認識しかつ作用することを指標に特定のアミノ酸配列のペプチドを選択する手法はなかった。



安定なおよび/または所望の抗菌スペクトルを有する生体防御ペプチドを得るために、既知のペプチド配列を改変し、目的に応じた活性を増強したペプチドを作出するなどの試みが行われている。例えば、コンビナトリアルケミストリーなどの方法を用いるハイスループットスクリーニングが、近年さかんに行われている(例えば、Sylvie E.Blondelle and Richard A.Houghten,TIBTECH,14:60-64(1996)、Hong,S.Y.ら、Antimicrobial Agents and Chemotherapy,42:2534-2541(1998)、およびKyoung-Chul Choiら、Biotechnology Letters,24:251-256(2002)を参照のこと)。しかし、ランダムペプチドライブラリーから微生物細胞膜に特異的に作用するペプチドを得たという成功例は報告されていない。また、一定の鎖長以上のペプチドライブラリーを合成することも、スクリーニング後に直接ペプチドのアミノ酸配列を決定することも困難である。そこで、ペプチドのアミノ酸配列と遺伝子情報を対応付けることにより、ペプチドをコードする塩基配列側からペプチドのアミノ酸配列を決定する方向で研究が進展してきた(例えば、ファージディスプレイ、細菌表層ディスプレイ、酵母表層ディスプレイなど(例えば、土屋信英、柳川弘志著「進化分子工学を構成する技術(3)遺伝子型と表現型の対応化技術」、化学と生物、第37巻:811-815(1999)、およびN.Doi and H.Yanagawa、Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening,4:497-509(2001)を参照のこと))。しかし、これらの手法はいずれも、生きた細胞を使ってタンパク質を合成する技術であり、微生物やファージなどの生物の力を利用する段階を含んでいるため、生体防御ペプチドのような、生物に致死的なペプチドおよび生物の増殖に影響を与える可能性のあるペプチドのアミノ酸配列を選択することは不可能であった。



これに対して、リボソームディスプレイやエマルジョン法などのように、スクリーニングの全過程を、無細胞系、すなわち、微生物やファージなどの生きた細胞の力を利用せずにインビトロで行う技術の開発が進められている(例えば、N.Doi and H.Yanagawa、Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening,4:497-509(2001)、Anthony D.Keefe and Jack W.Szostak,Nature,410(2001)、およびPatrick Amstutzら、Current Opinion in Biotechnology,406-405(2001)を参照のこと)。特に、リボソームディスプレイは、タンパク質・リボソーム・mRNA複合体(PRM複合体)を形成させ、特定の機能を持ったタンパク質をスクリーニングする手法である。このような方法を用いることによって、生物に致死的なペプチドおよび生物の増殖に影響を与える可能性のあるペプチドのアミノ酸配列を選択し得る。



しかし、タンパク質のスクリーニングの選択圧の開発が困難であり、上記の方法は、今のところ方法論の開発が主となっているに過ぎない。従って、生体膜に特異的に作用する新規ペプチドをスクリーニングする方法に関しての成功例は、未だ報告されていない。
【特許文献1】
特開2001-288105公報
【特許文献2】
特開2001-186887公報
【特許文献3】
特開2001-2582公報
【特許文献4】
特開2000-63400公報
【特許文献5】
特表2002-503701公報
【特許文献6】
特表2002-503641公報
【特許文献7】
特表2001-527412公報
【特許文献8】
特表2001-517422公報
【特許文献9】
特表平9-512711公報
【特許文献10】
特許第2967925号明細書
【非特許文献1】
Michael Zasloff,Nature 415:389-395(2002)
【非特許文献2】
松崎勝巳著「抗菌性生体防御ペプチド:作用機構とその応用」FFI JOURNAL,No.190:23-27(2001)
【非特許文献3】
Sachiko Machidaら、Biosci.Biotechnol.Biochem.,64:985-994(2000)
【非特許文献4】
Song Yub Shinら、Biochemical Biophysical Research Communications,275:904-909(2000)
【非特許文献5】
Sylvie E.Blondelle and Richard A.Houghten,TIBTECH,14:60-64(1996)
【非特許文献6】
Hong,S.Y.ら、Antimicrobial Agents and Chemotherapy,42:2534-2541(1998)
【非特許文献7】
Kyoung-Chul Choiら、Biotechnology Letters,24:251-256(2002)
【非特許文献8】
土屋信英、柳川弘志著「進化分子工学を構成する技術(3)遺伝子型と表現型の対応化技術」、化学と生物、第37巻:811-815(1999)
【非特許文献9】
N.Doi and H.Yanagawa、Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening,4:497-509(2001)
【非特許文献10】
Anthony D.Keefe and Jack W.Szostak,Nature,410(2001)
【非特許文献11】
Patrick Amstutzら、Current Opinion in Biotechnology,406-405(2001)

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、生体膜に特異的に作用する新規ペプチドおよびそのスクリーニング方法に関し、具体的には、微生物細胞膜に特異的に作用するが、正常な動物細胞膜に作用しないペプチドおよびそのスクリーニング方法に関する。さらに本発明は、微生物細胞膜に対して特異的ポア形成能を有するが溶血能を欠くペプチドおよびそのスクリーニング方法に関する。本発明は、微生物を殺傷するための抗菌ペプチドに関する。具体的には、本発明は、食品または工業製品の腐敗の原因となる微生物に対する抗菌ペプチドに関する。本発明はまた、動物および/または植物に感染する微生物に対する抗菌ペプチドに関する。また、本発明は、本発明のペプチドを含む、微生物を殺傷するための薬学的組成物、微生物による感染症を処置するための薬学的組成物、癌の処置のための薬学的組成物、またはアポトーシスを抑制するための薬学的組成物に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
配列RNWRGIAGMARRLLGRNWRLMを含む、ペプチド。

【請求項2】
 
請求項1に記載のペプチドを含有する、微生物を殺傷するための薬学的組成物。

【請求項3】
 
請求項1に記載のペプチドを含有する、食品または工業製品の腐敗を予防するための薬学的組成物。

【請求項4】
 
請求項1に記載のペプチドを含有する、微生物による感染症を処置するための薬学的組成物。

【請求項5】
 
請求項1に記載のペプチドを含有する、抗生物質。

【請求項6】
 
請求項1に記載のペプチドを含有する、微生物感染部位に薬物を送達するための、薬学的送達物。

【請求項7】
 
請求項1に記載のペプチドを含有する、癌を処置するための薬学的組成物。

【請求項8】
 
請求項1に記載のペプチドを含有する、癌病変部位に薬物を送達するための、薬学的送達物。

【請求項9】
 
請求項1に記載のペプチドを含有する、アポトーシスを抑制するための、薬学的組成物。

【請求項10】
 
請求項1に記載のペプチドを含有する、アポトーシスが進行する部位に薬物を送達するための、薬学的送達物。

【請求項11】
 
前記微生物が、動物病原性である、請求項2~6のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項12】
 
前記微生物が、植物病原性である、請求項2~6のいずれか一項に記載の薬学的組成物。

【請求項13】
 
前記植物病原性微生物が、エルウィニア・カロトボラ(Erwinia Carotovoraである、請求項12に記載の薬学的組成物。

【請求項14】
 
前記癌が、膀胱癌、胃癌、乳癌、肺癌、前立腺癌、グリア芽腫、大腸癌、子宮癌、卵巣癌、腎癌および白血病からなる群より選択される、請求項7または8に記載の薬学的組成物。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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25381_01SUM.gif
State of application right Registered


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