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DEVELOPMENT OF METHOD FOR JUDGING SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM OF RICE GENOM AND APPLICATION TO DISCRIMINATION OF RICE SPECIES

Patent code P04A006018
File No. 植物バイオ-162
Posted date Feb 16, 2005
Application number P2003-045191
Publication number P2004-248635A
Patent number P4344818
Date of filing Feb 21, 2003
Date of publication of application Sep 9, 2004
Date of registration Jul 24, 2009
Inventor
  • (In Japanese)田淵 宏朗
  • (In Japanese)林 敬子
  • (In Japanese)芦川 育夫
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
Title DEVELOPMENT OF METHOD FOR JUDGING SINGLE NUCLEOTIDE POLYMORPHISM OF RICE GENOM AND APPLICATION TO DISCRIMINATION OF RICE SPECIES
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a simple method for the discrimination of the polymorphism of a genom DNA in high reproducibility.
SOLUTION: The problem is solved by the use of a PCR primer for the discrimination of single nucleotide polymorphism. The 3' terminal of the primer corresponds to the position of the target single nucleotide polymorphism and the 3rd base from the 3' terminal of the primer is substituted with a base complimentary to a template sequence annealed by the primer. The substitution is G to T, A to C, T to G, or C to A substitution. The method can be used e.g. in a DNA marker for the discrimination of rice species or the breeding and selection of rice.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


近年、ゲノムDNAの多型性に基づく品種の識別法が開発されている。



PCR法を使用しないDNA多型の検出方法としては、AFLP(Amplifiled Fragment Length Polymorphism)が挙げられる。AFLP法は、1990年代に開発された、個体間、品種間のゲノムDNAの相同性を検出するゲノムフィンガープリント法であり(Vosら(1995)AFLP:a new technique for DNA fingerprinting. Nucleic Acids Res. 23、4407~4414)、現在は、AFLPのためのキットも市販されている(例えば、AFLP Analysis system、Invitrogen社、Carlsbad、CA、USA)。この方法は、(1)ゲノムDNAを2種の制限酵素で処理し、アダプターを連結する、(2)アダプター配列に基づくプライマーを使用してPCRを行う(このプライマーは、アダプター配列の3’末端に特定の鋳型のみを増幅するための選択塩基を加えた配列を有する)、(3)増幅産物を、電気泳動によって分離し、特異的な増幅産物の有無を検出する、という工程を包含する方法である。この方法は、反応に必要なDNAが大量に必要であり、PCRと比較して工程が複雑であり、しかも、制限酵素認識部位以外での1塩基レベルの変化を判別することができないという欠点を有する。



近年、PCR法を用いた多型の判別法が開発されている。PCR法の原理を使用した、ゲノムDNAの多型の識別法としては、マイクロサテライト法、RAPD法(random amplified polymorphic DNA method)、RAPD由来STS(sequence tagged site)法などが用いられている。しかし、これら従来法には、以下の欠点がある。



マイクロサテライト法は、ゲノムDNA中に存在する数塩基の反復配列(マイクロサテライト)を増幅して、その反復配列の繰り返しの数の違いという多型性を判別する方法である。この方法は、数塩基の反復配列の反復数の差異というわずかなPCR増幅フラグメント長の差異を検出する方法であるため、増幅産物の解析の際に、高濃度のゲルを作成し、かつ慎重に長時間電気泳動をする必要がある。また、1塩基多型を判別できないという欠点を有する。



RAPD法は、一般に12塩基程度のランダムプライマーを使用して、ゲノムDNAを増幅し、増幅されたバンドのパターンを電気泳動によって検出することによる、多型の判別方法である。RAPD法は、プライマーの調製は簡便ではあるものの、PCRの条件を厳密に設定する必要があり、しかも、わずかな条件(例えば、温度)の差異によって異なる結果が生じる。従って、RAPD法では、PCR条件の設定が困難であり、かつ条件を設定しても、再現性に乏しく、安定的な判別が困難である。また、RAPD法は、鋳型DNAの純度の影響を受け、さらに、複数回のPCRと電気泳動が必要であるという欠点もある。



RAPD由来STS法は、RAPD法によって同定された特異的なバンドの配列決定を行い、その配列情報に基づいてプライマーを設計して、PCRを行う方法である。この方法は、RAPD法によって同定されたバンドに基づく方法であるため、塩基配列がかなり異なる多型を有するゲノム部分でのみ使用可能であり、1塩基置換を判別することが困難である。



SNPs法は1塩基多型の遺伝子型を判別することができる方法ではあるが、安定的な判別のためには、PerkinElmer社(Boston、MA、USA)のマルチラベルカウンターのような高価な装置を使用する必要がある。



本発明は、これら従来法の欠点を克服し、簡便かつ再現性の高い1塩基レベルの多型を判別するためのPCRプライマーを提供するものである。



DNA多型判別方法の適用例として、ゲノムDNA配列の多型性に基づく品種識別も、近年重要になっている。例えば、イネの場合、古典的な品種識別は、交配させた場合の稔実性、イネの草型、米の粒型、酵素多型等の比較により行われてきた。しかし、これらの古典的な技術は、インディカとジャポニカの識別や、インディカ同士あるいはジャポニカ同士でも遠縁のイネの識別には有効である一方で、近縁の米の識別に供するには不十分であった。近年のように「コシヒカリ」を中心として開発された近縁良食味米同士の識別に用いることは不可能であるという問題がある。



食糧法の施行に伴って、精米の品種、産地、産年を精米の包装に表示することが義務づけられた。これらの表示は品種識別の指標の一つとなりうるが、これらの他に植物体や籾、玄米の情報がない場合には、近縁の良食味米の品種を識別することは極めて困難である。



最近では、コンビニエンスストア、業務用炊飯サービス、外食産業等で米飯として供給される米についても、品種の特定が必要とされている。しかし、炊飯による澱粉の糊化、タンパク質の変性等が起こるため、古典的な技術によって、DNAの抽出や品種の識別を行うことは不可能である。



しかしながら、ゲノムDNAの多型性を識別する従来方法には、上記のような欠点がある。そのため、簡便、かつ再現性の高い多型性の識別方法が求められている。



ゲノム分析による品種識別と原理を同じくする、DNAマーカー選抜育種におけるゲノム上の多型判別技術も、現行技術は同様な欠点を持ち、簡易で、かつ信頼のおける多型の識別技術が必要である。



【特許文献1】
公開特許公報 特開平6-113850号
【特許文献2】
公開特許公報 特開平6-113851号
【特許文献3】
公開特許公報 特開平6-113852号
【特許文献4】
公開特許公報 特開平7-39400号
【特許文献5】
公開特許公報 特開2001-95589号

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、主にイネの品種識別方法に属する。加えて、本発明の技術は、イネの育種選抜において有用形質を選抜するためのDNAマーカーとしても応用可能である。本発明の方法は、一粒の米飯またはイネの植物体より抽出したDNAから、ゲノムDNA中の1塩基レベルの差を簡便に判別して、イネの品種を識別する方法に関する。



さらに、本発明は、イネの品種識別のみならず、例えば、選抜用DNAマーカーとして、1塩基レベルの差の判別能を利用して、DNAマーカー部位の遺伝子型決定を行う方法に属する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
以下(A)または(B)のプライマー対を含むプライマーのセット:
(A)
(1)配列番号1および2;
(2)配列番号3および4;
(3)配列番号5および6;ならびに
(4)配列番号7および8
(B)
(1)配列番号1および2;
(3)配列番号5および6;
(4)配列番号7および8;ならびに
(5)配列番号9および10。

【請求項2】
 
以下(A’)または(B’)のプライマー対を含むプライマーのセット::
(A’)
(1)配列番号1および2;
(2)配列番号3および4;
(3)配列番号5および6;
(4)配列番号7および8;ならびに
(6)配列番号11および12、
(B’)
(1)配列番号1および2;
(3)配列番号5および6;
(4)配列番号7および8;
(5)配列番号9および10;ならびに
(6)配列番号11および12。

【請求項3】
 
請求項1に記載のプライマーセットを使用する、イネゲノムの1塩基多型の遺伝子型の判別方法。

【請求項4】
 
請求項1に記載のプライマーセットを含む、イネゲノムの1塩基多型の遺伝子型を判別するためのキット。

【請求項5】
 
請求項4に記載のキットであって、さらに、以下のプライマー対:
(6)配列番号26および27;
(7)配列番号30および31;
(8)配列番号32および33;
(9)配列番号34および35;
(10)配列番号36および37;
(11)配列番号38および39;
(12)配列番号40および41;
(13)配列番号42および43;
(14)配列番号44および45;
(15)配列番号46および47;ならびに
(16)配列番号48および49;
からなる群から選択されるプライマー対を含む、イネゲノムの1塩基多型の遺伝子型を判別するためのキット。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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25384_01SUM.gif
State of application right Registered


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