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METHOD FOR DETECTING PATHOGENIC MICROBE BY MULTIPRIMER PCR TECHNIQUE

Patent code P04A006048
File No. 測定・分析-43
Posted date Feb 16, 2005
Application number P2000-049760
Publication number P2001-231575A
Patent number P3449961
Date of filing Feb 25, 2000
Date of publication of application Aug 28, 2001
Date of registration Jul 11, 2003
Inventor
  • (In Japanese)畠山 吉則
  • (In Japanese)早坂 昭二
  • (In Japanese)米村 真之
Applicant
  • (In Japanese)国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構
Title METHOD FOR DETECTING PATHOGENIC MICROBE BY MULTIPRIMER PCR TECHNIQUE
Abstract PROBLEM TO BE SOLVED: To provide a method for detecting a plural species of pathogenic microbes by a single test alone using one tube per individual object, and to provide a method for easily identifying such pathogenic microbes as well by setting conditions so as to amplify DNA fragments differing in size for the corresponding respective pathogenic microbes.
SOLUTION: This method for simultaneously detecting plural species of microspora in a test animal body comprises the following practice: a amplification treatment is performed, using a nucleic acid present in the test animal as template, with a mixed primer comprising at least two primer pairs capable of amplifying the partial domains of the respective genomic DNAs of a plural species of microspora to be detected.
Outline of related art and contending technology (In Japanese)


現在、動物に対する病原生物としては、ウイルス、細菌、真菌、寄生虫、原生動物など、様々なものが知られている。上記病原生物の一種である微胞子虫類(Microsporida)は、Microspora(微胞子虫門)に属する原虫であり、原生生物から哺乳動物まで広範な動物細胞に寄生することが知られている。また、寄生した微胞子虫は、その宿主において様々な病害を惹き起こすことが知られている。例えば、微胞子虫の一種であるノセマ・ボンビシス(Nosema bombycis)は主として蚕に寄生し、微粒子病を惹き起こす。従って、蚕等の有用動物に微胞子虫が感染しているかどうかをできるだけ迅速に検定する必要がある。
従来、一般に、病原が判定できない感染症の場合に病原生物を検出するためには、その症状から病原生物を予想し、それぞれを検出するための検査を個別に行っていた。従って、一個体につき複数の検査を行う必要があったが、このような検査の方法としては、検出対象である病原に対する抗体を用いる方法、病原菌の菌体を培養する方法等が主に用いられるため、大量の個体を検査するためには多くの時間を必要とした。
特に、蚕に感染する微胞子虫の検定は、各微胞子虫の胞子に反応する特異的な抗体を用いる方法によって行われるため、熟練の技師が検定を行う必要があった。また、胞子が未形成の場合には検出することができず、さらに感染量の少ない卵の検定は非常に困難であった。そこで、熟練者でなくても簡便に微胞子虫を検出できる方法が開発されれば便利である。

Field of industrial application (In Japanese)


本発明は、動物に感染した病原生物の検出方法に関し、より詳細には、動物に感染した微胞子虫、又は昆虫に感染した昆虫病原生物のPCRによる検出方法に関する。

Scope of claims (In Japanese)
【請求項1】
 
被検動物体内に存在する核酸を鋳型とし、検出しようとする複数種の微胞子虫それぞれのゲノムDNAの部分領域を増幅し得る少なくとも2種のプライマーペアを含む混合プライマーを用いて増幅処理を行うことを含む、該被検動物体内の該複数種の微胞子虫を同時に検出し得る方法であって、該混合プライマーが、下記(i)~(iv):
(i)配列番号1で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び配列番号2で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
(ii)配列番号3で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び配列番号4で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、
(iii)配列番号5で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び配列番号6で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、並びに
(iv)配列番号7で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び配列番号8で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、からなる群より選択される少なくとも2種のプライマーペアを含む、前記方法。

【請求項2】
 
検出しようとする前記複数種の微胞子虫が、ノセマ・ボンビシス、バイリモルファsp. M11、バイリモルファsp. M12、バイリモルファ・ネカトリクス及びプレイストフォラsp. PSDからなる群より選択される少なくとも2種の微胞子虫である請求項1記載の方法。

【請求項3】
 
検出しようとする前記複数種の微胞子虫が、ノセマ・ボンビシス、バイリモルファsp. M11、バイリモルファsp. M12、バイリモルファ・ネカトリクス及びプレイストフォラsp. PSDである請求項2記載の方法。

【請求項4】
 
被検動物体内に存在する核酸を鋳型とし、配列番号1~8で表わされる塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含む混合プライマーを用いて増幅処理を行うことを含む、該被検動物体内の該複数種の微胞子虫を同時に検出し得る方法。

【請求項5】
 
前記被検動物が昆虫である請求項1記載の方法。

【請求項6】
 
昆虫がカイコガ(Bombix mori)である請求項5記載の方法

【請求項7】
 
(i)配列番号1で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び配列番号2で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、(ii)配列番号3で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び配列番号4で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、(iii)配列番号5で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び配列番号6で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーペア、並びに(iv)配列番号7で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチド及び配列番号8で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドからなるプライマーペアからなる群より選択される少なくとも2種のプライマーペアを含む、微胞子虫検出用プライマーセット

【請求項8】
 
配列番号1~8で表わされる塩基配列を含むオリゴヌクレオチドを含む請求項7記載の微胞子虫検出用プライマーセット。
IPC(International Patent Classification)
F-term
Drawing

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09651_05SUM.gif
State of application right Registered


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