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環状二本鎖ＤＮＡおよびそれを用いたＤＮＡの増幅方法


シーズコード	S120008913
掲載日	2012年2月17日
研究者	高橋宏和杉山滋
技術名称	環状二本鎖ＤＮＡおよびそれを用いたＤＮＡの増幅方法
技術概要	２種の出発材料となる直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片を用意し、一方の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片Ａについて、制限酵素Ｘで切断した後、両末端を脱リン酸化し、制限酵素Ｘとは異なる制限酵素Ｙで切断し、他方の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片Ｂについても、制限酵素Ｙで切断した後、両末端を脱リン酸化し、制限酵素Ｘで切断する。２種の直鎖状二本鎖ＤＮＡ断片Ａ、Ｂは両方とも、一方の末端が脱リン酸化されており、他方の末端が脱リン酸化されていない状態となる。これらのＤＮＡ断片Ａ、Ｂをライゲーションすると、３種類のＤＮＡ結合産物が得られ、直鎖状ＤＮＡ特異的なエクソヌクレアーゼにより分解処理することによって、環状二本鎖ＤＮＡだけを得る。得られた環状二本鎖ＤＮＡは、一方の鎖にはニックがない状態、他方の鎖にはニックが２つ存在する状態になる。ニックを有する鎖におけるニック間のＤＮＡ鎖が、ＤＮＡの増幅反応において、初期プライマーとして働く。すなわち、ＤＮＡの伸張反応によってニックの位置からＤＮＡが合成されていき、鋳型の環状二本鎖ＤＮＡの配列が、樹状構造状に１０^５～１０^１３回程度繰り返した配列を有するＤＮＡ増幅産物を産生する。
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研究分野	遺伝子の複製
展開可能なシーズ	ＤＮＡを簡易な手順で特異的に増幅する方法、とくに目的となるＤＮＡが極微量であっても特異的に増幅することができる方法を提供する。鋳型が極微量であっても増幅効率が高く、また目的以外のＤＮＡ増幅のない極めて特異性の高いＤＮＡ増幅が、簡便な手順で短期間に行うことが可能である。さらに、鋳型のサイズが限定されず、通常の大きさのもののほか、極めて大きなサイズ（例えば、２０ｋｂｐを超えるもの、数１０～数１０００ｋｂｐのもの、さらにそれを超えるサイズのもの）を増幅可能である。さらにまた、生物細胞を経由せずに試験管内において、任意のＤＮＡ断片を増幅することができることから、従来の方法では不可能であった大腸菌等の生体内で致死的に働く遺伝子の増幅が可能となる。また、大腸菌等の生体内で頻繁に組み換えを引き起こす配列、例えばレトロウイルス様配列の増幅も可能である。さらにまた、とくに医療用として期待の高いウイルスベクターの増幅において、生物細胞内を経由していないため、エンドトキシン等の毒性物の混入を防ぐことが可能であり、この点においても本発明は極めて有効である。
用途利用分野	ＤＮＡ増幅用試薬、ＤＮＡ増幅キット
出願特許		特許	国際特許分類(IPC)
出願特許	( 1 )	国立研究開発法人農業・食品産業技術総合研究機構， . 高橋宏和，杉山滋， . 環状二本鎖ＤＮＡおよびそれを用いたＤＮＡの増幅方法. 特開2010-051182. 2010-03-11	C12N 15/09 C12Q 1/68